体外转录试炼，始于模板设计

体外转录是一种常见的实验手段，在基因编辑、蛋白表达、蛋白功能研究、单细胞测序等众多领域都有广泛应用。

体外转录的DNA模板必须包含RNA聚合酶结合启动转录所需的 双链启动子区域。转录模板有以下几种类型：

质粒

许多常用的质粒克隆载体均有RNA聚合酶启动子，通常包含两个不同的启动子，在多克隆位点两侧各一个，从而可以对插入序列的任一条链进行转录。

用作转录模板的质粒需要通过限制性内切酶消化线性化。因为转录反应会延续至DNA模板的末端，线性化可以确保获得确定长度及序列的RNA转录本。

限制性内切位点无需是独一无二的，只要确保启动子与转录模板保持相邻，载体本身可以被多次酶切消化。

限制性内切酶消化后应当进行纯化，因为酶切反应中的残留物可能会抑制转录反应。

PCR产物

可以通过将启动子序列添加至上游或下游PCR引物的5’端从而将启动子添加至PCR产物中。这些序列通过PCR反应会形成双链启动子序列。

寡核苷酸

将两条带有启动子序列的互补寡核苷酸通过简单的退火反应即可形成双链DNA模板。事实上只需要使部分的DNA模板（RNA聚合酶启动子的-17到+1位碱基）形成双链即可。

因此，只需合成一条短寡核苷酸和一条长链即可获得非对称杂交链，成本更低。

cDNA

近来体外转录逐渐被应用于aRNA扩增反应。对于这类反应，可以在反转录过程中使用oligo(dT)-T7启动子引物，以RNA为起始材料获得转录模板。cDNA可以通过第二链合成反应转化为双链转录模板。

确定了模板类型，接下来考虑的问题是：正义链还是反义链？

若RNA是要用作与mRNA杂交的探针（例如：Northern blot、原位杂交、核酸酶保护实验等），则需要互补的反义链转录本。反之，当进行表达、结构或功能研究时，或使用人工正义链RNA来构建RNA定量的标准曲线时，则需要正义链转录本。

DNA模板上的RNA聚合酶启动子序列+1 G是转录产物中的第一个碱基。

• 若要获得正义RNA，编码链的5’末端应当与启动子的+1 G相连，或正好处于下游。

• 若要转录反义RNA，则是非编码链的5’末端应当与+1 G相连。

• 若插入片段是在载体中，则应当在启动子和需转录插入序列的下游对载体进行线性化。

完成模板设计，接下来可以进行转录啦。我们为您提供了适用于不同启动子的体外转录试剂盒：