蛋白质Western-Blot检测操作程序(转)默认分类 2007-12-25 17:52:51 阅读991 评论0 字号:大中小 订阅 一.所需仪器设备 1.电泳仪 2.垂直电泳槽 3.转移电泳槽:湿转或半干转电泳槽 4.硝酸纤维素膜(NC膜) 5.暗盒 6.5x7cm X胶片 [注:电泳槽、玻璃板、梳子及胶条的清洗:自来水冲洗数次――去离子水冲洗数次2次――37C烤干备用。] 二.所用试剂 [注:配制及稀释试剂均用去离子水,实验器皿自来水清洗完毕再用去离子水冲洗] 1.Lysis buffer:RIPA 三去污剂裂解缓冲液 50mM Tris.Hcl 3.03g 150mM NaCl 生理盐水 4.35g 0.02%NaN3(防腐剂,可以不加) 0.1g 0.1%SDS 强阴离子去污剂 0.5g 1% NP-40 去污剂 5ml 0.5% Sodium deoxycholate 去氧胆酸钠 去污剂 2.5g 配制500ml,10M盐酸调PH8.0, 4度保存。 使用前按1:50加入100mM PMSF(苯甲基磺酰氟,平时放-20度)和protease inhibitor(先溶在2ML水中,分装在小管中,保存在-20度),配好后马上使用。也可分装成(RIPA300ul+6ul100mM PMSF+6ulprotease inhibitor)(培养细胞及微小组织蛋白提取)若干管,-20度保存;分装成(RIPA1000ul+20ul100mM PMSF+20ulprotease inhibitor)(较大组织蛋白提取)若干管,-20度保存。 [注:也可使用单去污剂裂解缓冲液,将1% NP-40换为1%Triton X-100。去掉0.1%SDS及0.5% Sodium deoxycholate 去氧胆酸钠] PMSF储存液 100mM(17.4mg/ml),溶于异丙醇。有效浓度100ug/ml。 2.150mM Nacl(0.87%Nacl,生理盐水) 3.0.1mg/mL考马斯亮兰G-250溶液 蛋白定量用。用50ml 95%乙醇溶解100mg考马斯亮兰G-250,再加入100ml 85%磷酸,加水至1000ml。用Whatman滤纸过滤后,置棕色瓶4度保存。蛋白定量比色皿可用95%乙醇脱色。 4.考马斯亮兰脱色液 含50%甲醇、10%冰醋酸、40%去离子水。 5. 0.25%考马斯亮兰R-250溶液 染色用。100ml脱色液中加入0.25g考马斯亮兰R-250。 6.10mg/mlBSA,称取100mg小牛血清白蛋白溶于10ml灭菌去离子水中。置-20度冰箱保存。 7.1mol/L Tris-Hcl缓冲液,PH6.8 8.1.5 mol/L Tris-Hcl缓冲液,PH8.8 9.10% AP:过硫酸铵(Ammonium Persulfate,AP),Amresco分装,为促凝剂,现配现用,准确称取AP 20mg于0.5ml离心管内(注:称量时可分装数管室温保存备用)临用前加去离子水200ul溶解。配制好的AP溶液4C可保存1周。 10.TEMED,Amresco分装,100ml包装,为促凝剂,准确吸取TEMED 10ul于0.2ml离心管内,可分装数管室温保存备用。 11.10% SDS 在90ml去离子水中溶解10g电泳级SDS,加热至68℃助溶,加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2,加入去离子水定容至100ml,室温保存。 12.30% Acr 将29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中,加热至37℃溶解之,补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器(0.45孔径)过滤除菌查证该溶液的pH值应不大于7.0,置棕色瓶中4度保存。 13.6xLoading buffer:6倍sample buffer 300mM tris.Hcl pH=6.8 , 12% SDS ,0.6% bromophenol blue (溴酚蓝),60%Glycerol,甘油 Filted,分装在1ml tube, 每毫升加43ul B-ME(β-巯基乙醇,还原剂),-20度保存。 14.蛋白Marker: 选择最适分子量Marker(MBI公司蛋白Marker很好) 15.内参:可选择最适分子量内参做1:3000-5000稀释,如B-Actin(45KD,浆蛋白用)、GAPDH(36KD,浆蛋白用,上海康成生物经销)、B-Tubulin(核蛋白用)等。 16.1xTris-Glycine电泳缓冲液(PH8.3) 25mM tris,192mM Glycine, 0.1%(w/v)SDS, 500ml配方如下 Tris1.515g, glycine7.2g, SDS0.5g用去离子水加至500ml。加10M HCl约800ul,就可以调至pH8.3。 17.1xTransfer buffer(PH8.3) 25mM tris, 192mM Glycine, 20%Methanol(甲醇),ph为8.3 500ml配方如下 Tris 1.515g,glycine7.2g,100ml Methanol(甲醇),用去离子水加至500ml。加10M HCl约550ul,就可以调至pH8.3。 18. TBST Washing buffer: 50mM tris, 150mM Nacl, 0.1% Tween-20 1L配方如下 Tris 6.06g,NaCl8.7g,1mlTween-20,加入去离子水至1L,同时精确调准pH值为7.6。加10M HCl约4200ul,就可以调至7.6。Tween-20要在用前现加,未加Tween-20的称为TBS缓冲液。 19.5%的脱脂奶粉封闭液 用TBST Washing buffer配制。 20.一抗:santa原装或北京中山分装,一般做1:200-300稀释。 21.HRP标记二抗:一般做1:3000-5000稀释。二抗选择原则如下: 如一抗为鼠抗人IgG, 二抗选择羊抗(或兔抗)鼠HRP; 如一抗为羊抗人IgG, 二抗选择鼠抗(或兔抗)羊HRP; 如一抗为兔抗人IgG, 二抗选择羊抗(或鼠抗)兔HRP。 22.ECL化学发光显色剂,或DAB显色剂 三.总蛋白质提取 1.培养细胞 1.1贴壁细胞数目达到培养皿(或培养瓶)底面积80-90%,最好前一天换上新的培养液。 1.2将培养液吸净,用5ml左右4度PBS洗三次细胞平皿(洗净培养液中的胎牛血清等外源性蛋白),将PBS吸净,加入triple-detergent lysis buffer,100mm培养皿加300ul。(蛋白质种类不同—浆蛋白、核蛋白、膜蛋白,细胞裂解液有所不同)如暂时不提取,可将培养皿-80度保存。 1.3轻轻的转动培养皿直到细胞被溶解下来,细胞刮轻轻刮下裂解物,并可见白色的核酸(DNA、RNA)沉淀,(约1分钟)将所有的液体包括沉淀,吸入1.5ml离心管,旋涡混匀器30秒,放在冰上10分钟使细胞充分裂解,然后,用4度离心机12000转10分钟。 1.4留10ul上清液做蛋白定量外,其余上清于另一1.5ml离心管(将蛋白样品5份+1份6×loading buffe,6×loading buffe加入前用80度左右的水预热一下,使其溶解充分。把样品在100度的沸水中煮5分钟使蛋白变性,离心管上标明蛋白含量,保存在-80度冰箱) 2.组织中蛋白提取 2.1特小的组织加300ulLysis buffer玻璃匀浆器中,冰浴中研磨数次,匀浆上清液吸入1.5ml离心管中,然后,用4度离心机12000转10分钟。吸取上清于另一1.5ml离心管,分装,保存在-80度冰箱。留10ul上清液做蛋白定量。 2.2取50-100mg组织放入玻璃匀浆器中,加3倍体积Lysis buffer,冰浴中研磨数次,匀浆上清液吸入1.5ml离心管中,然后,用4度离心机12000转10分钟。吸取上清于另一1.5ml离心管,分装,保存在-80度冰箱。留10ul上清液做蛋白定量。 四.蛋白质定量 1.应用标准的Bradford法定量。 2.待测样本各10ul+90ul生理盐水;标准管中分别加入10mg/mlBSA 0ul、2.5ul、5.0ul、7.5ul、10ul, 每管加生理盐水至100ul(蛋白含量分别为0、25、50、75、100ug),同时以100ul的生理盐水作空白对照。各管加入考马斯亮蓝染料溶液1900ul至总体积2ml,混匀,室温放置2分钟。比色检测作标准曲线,计算出各个样品的蛋白含量。 3.比色定量:通过OD值,来计算蛋白量。统计软件计算出结果; 五.样品准备 1.将已定量的蛋白样品5份+1份6×loading buffe,6×loading buffe加入前用80度左右的水预热一下,使其溶解充分。把样品在100度的沸水中煮5分钟, (水中煮沸5分钟,目的是让蛋白变性,由四级结构变成一级结构。注意事项:煮沸时,一定不要让离心管口弹开进入水,要随时观察。) 2.一般来讲蛋白上样量30ug;计算出每个样品30ug所用的体积,在样品管上标记体积数值,以后直接吸取就行了。 3.等体积上样:用事先准备好1×loading buffer,调成15ul相同体积。这样条带整齐。 六.蛋白电泳 1.分离胶制备 1.胶的选择:胶的浓度越大,所能分离蛋白的分子量越小。(阿恒觉得这里一般还是10%到15%的比较常用) 7.5% :45—200KD 10%: 31----200KD 12%: 21.5---200KD 15%6.5---200KD 2.10ml 10%分离胶制备 去离子水 3950ul 30%Acr 3350ul 1.5MTris-Hcl,PH8.8 2500ul 10%SDS 100ul 混匀;依次快速加入10%AP 100ul及TEMED 4ul,充分混匀但不要产生气泡。(这部很关键) 3.立即灌胶,不要产生气泡,如有气泡可用10ml注射器针头排除。在每侧胶板加胶至红色塑料板的下缘处即可(差不多4-5ml) 4.沿玻璃板壁缓慢加去离子水1cm高度,隔绝空气,分离胶室温凝固2小时以上。也可4度冰箱过夜。 2.5%积层胶制备 (配制积层胶前先倾斜玻璃板,使上面水层汇聚于一边,用10ml注射器吸取干净,静置10分钟左右,使水分蒸发干净) 2.1 4ml 5%积层胶制备 去离子水 2800ul 30%Acr 660ul 1MTris-Hcl,PH6.8 500ul 10%SDS 40ul 混匀;依次快速加入10%AP 40ul及TEMED 4ul,充分混匀但不要产生气泡。立即灌胶,不要产生气泡,如有气泡可用10ml注射器针头排除。 2.2插上梳子,积层胶室温凝固30分钟以上。小心拨出梳子,若胶孔有歪斜,则用注射器加以修正,吸出气泡;(歪斜一般出现在基层胶凝固时间过短,或者配置比重过低,可用针头拨乱反正之,但是难度很高,容易挑破) 2.3去掉胶条,加入甘氨酸电泳缓冲液,内外持平; 2.4清洗胶孔:去除没有凝聚的Acr,并清除气泡。 3.点样:使用20ul的加样枪,采用“对侧加样法”加样。 4.电泳 电泳在4度冰箱中进行,积层胶90V,30分钟左右,待溴酚兰指示剂到达分离胶表面时改变电压120-130V,2小时左右――此方法可以保持胶内受热均匀,电流、电场均匀,条带齐规整) 5.剥离胶:在平皿中,用手术刀片小心剥离,切掉积层胶,取出分离胶,用于下一步试验。 七.转膜 1.准备一大的玻璃培养皿, 2.Tansfer buffer:配制500ml(一部分倒于玻璃皿中,以分离胶-制作夹心饼);取胶-修剪胶:取胶时手应错开分离玻璃,使胶取出,去掉积层胶部分,修剪周边使其与预先制作好的硝酸膜大小一致,约长8cm、高5cm左右,NC膜用剪刀在一个角剪一个标记;制作夹心饼:黑负白正,从近负极面依次为“黑夹板=海棉-滤纸(5层)-胶-膜-滤纸(5层)-海棉=白夹板”形象“汉堡”或“夹心饼”;用玻璃棒赶尽气泡](这步要一层层的赶气泡,气泡非常影响转膜结果) 3. Transfer time 4度6-12小时(4C转膜过夜,时间根据分子量的大小调整,大分子可以12小时,小的6小时左右) 4.将膜取下,用去离子水洗。 八.Western blot blot之前可以用丽春红(ponceaus)染NC膜,以观察蛋白转膜情况(是否完全、条带是否齐)。然后用自来水或washing buffer洗掉丽春红后进行印迹。可以跑两块胶,一块blot,一块染色观察。(其实,恩,染过色的胶洗掉还是可以用的,吼吼!) 步骤: 1.裁膜:根据电泳后蛋白Marker的位置,裁剪所需目的蛋白、内参对应的膜。 2.封闭抗体:将膜放入自制blot袋;封闭液用5%的美国脱脂奶粉(用TBST wash buffer配制),blot with milk for 1h RT,也可4度过夜。(这个做袋袋,也是很有意思地 = = 哈哈!) 3.加一抗:blot in primary antibody for 1.5h RT(抗体用milk稀释) 4.洗膜:wash with TBST wash buffer 5times, each time 3mins 5.加二抗:blot in secondary antibody 1h RT (抗体用milk稀释) 6.洗膜:wash with TBST wash buffer 5times, each time 3mins 九ECL显色 1.加ECL试剂10ml于100mm玻璃培养皿中,再加30%双氧水6ul(带上手套,防止腐蚀皮肤)(万一腐蚀了,皮肤变成白色的,又疼又养,这是一个比偶倒霉的哥哥告诉偶的),摇匀。 2.用滤纸吸干NC膜上水分,将膜放入ECL显色液中显色,肉眼看到条带后,就可以取出,显色强的约几秒钟,显色弱的时间长些,但是不可以超过3分钟。 十.放射自显影,冲洗胶片 1.放射自显影操作在暗室进行。红色灯光下可避免底片曝光。切忌底片湿水。 2.用滤纸吸干膜上ECL显色液,先将膜放入暗盒内,再放X胶片,根据目的条带ECL显色的强弱决定曝光时间。 (伸手不见5指的曝光,经常大眼瞪小眼的看条带) 3.目的条带ECL显色肉眼可以看到的话,说明比较强,曝光时间可以短些,“3分钟、5分钟各一张+必不可以少的10分钟一张”;肉眼看不见,曝光时间可以长些,“不可以少的10分钟,15分钟、30分钟各一张”。 4.一般来说,曝光三张已足够用。(偶一口气爆上6张,左眼看3张,右眼看3张,嘿嘿~~) 5.放射科冲洗X胶片,读片。 6.X胶片扫描保存。 |
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