【原】Native PAGE及切胶回收纯化实验方法

一、Native-PAGE原理

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下， 对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。

二、Native-PAGE实验方法

非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。

三、工作液配制

1.30%胶贮液(Acr:Bis=29：1）;

2.4×分离胶Buffer(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃ 贮存；

3.4×堆积胶Buffer(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃ 贮存；

4.10×电泳Bufferfer（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1L，4℃ 贮存；

5.2×溴酚蓝上样Buffer:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20℃贮存；

6.10％APS； 

7.0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；

8.考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O。

四、电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）

1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)

2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C） 4.25ml 0.5ml
3. 4×分离胶Buffer(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8) 2.5ml 
4. 4×堆积胶Buffer(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml
5. 水 3.2ml
6. 10％APS  35 μl
7. TEMED 15 μl
8. 10×电泳Buffer（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到1L

五、电泳条件

100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
    染色和脱色：取出胶板于0.25％考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。也可以用银染或者活性染色。
六、分离碱性蛋白
　　要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：
    1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；
    2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；
    3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5
    将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂，实验操作同分离酸性蛋白。
七、切胶回收（单条带纯化）
    native-PAGE结束以后，可以将蛋白条带进行切胶回收的方法进行纯化，方法如下：先跑Native PAGE，然后用预冷的0.25M KCl染色（预先放在4度冰箱中），目的条带会出现白色条带，根据你已经跑过的考马斯亮蓝染色的位置可以判断哪条带是你的目的条带，如果蛋白浓度高的话，染1分钟就可以看到目的条带，蛋白浓度低的话，要染时间长一些，大概5-10分钟，如果太低，估计是看不到目的条带了。无法用此方法看到目的条带。那用该方法就不行了。

注意：蛋白浓度底，目的条带颜色很浅，要在背景深色的时候才能看到（可以放在透明的玻璃板上操作），因为这种染色方法灵敏度比考马斯亮蓝染色低很多。

当看到目的条带时，可用一干净的刀片切下目的蛋白所在的凝胶条带，将凝胶条放在蒸馏水里浸泡，直至无色透明，目的是使得KCl离开胶条（当然目的蛋白会损失一些，但绝大多数还在胶里，因为这个自由扩散的过程不会太久），一般也就是五到十分钟就可以目测观察到胶条变成无色透明状。

将无色透明的胶条从蒸馏水中取出，装入一准备好的1.5ml离心管中，用镊子夹碎（或在放入离心管之前用刀片切碎），我常用的是灭过菌的镊子夹碎。然后再在管里加入你所需要溶解蛋白的溶液，比如蒸馏水（生理盐水或PBS等）。将离心管放入4度冰箱过夜，第二天吸出管中的液体（吸之前震荡一下），至少50%蛋白可以从凝胶中析出（这要看你的凝胶和水溶液的体积比）。再加入蒸馏水抽提两次，就可以将胶条中绝大部分蛋白抽提出。

多次抽提的蛋白经Brandford考马斯亮蓝染色法测蛋白浓度测定，证明浓度依次递减，后一次的浓度均不超过上次的50%。对于后面抽提的浓度比较低的，可以进行浓缩。

切胶回收得到的蛋白浓度可达到1mg/ml。经电泳检测，只有单一条带。无任何杂带。

也可用普通的水平电泳槽回收蛋白：将条带装到透析袋里(透析袋截流量最好不要大过分子量的1/3)，利用电泳将蛋白从凝胶里分离出来，一般80V 2h即可。