Western blotting 常见问题分析
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问题
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可能原因
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建议解决方案
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转印膜上蛋白样品量少
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蛋白质上样量不足或蛋白样品中目的蛋白的含量低
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通过预实验确定最佳的上样量，保证目的蛋白的量在一抗的监测范围内
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转
膜
效
率
低
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转移缓冲液pH值与目的蛋白的等电点相近，蛋白质带所带的电荷不足以使蛋白泳动转移到膜上
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调整转移缓冲液的pH值，使目的蛋白在该环境下带负电利于转移
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蛋白质变性不充分
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在转移缓冲液中加入SDS，利于蛋白质的变性和转移
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转移过程中凝胶和转印膜之间存在气泡，使蛋白转移不完全
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操作中使用表面光滑的玻璃棒彻底地赶走凝胶和转印膜之间的气泡
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凝胶和转印膜俩侧的滤纸过大相互接触，造成电流直接从滤纸通过，蛋白质没有转移的推动力
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将凝胶和转印膜两侧的滤纸裁成与凝胶一般大小，对齐滤纸，转印膜及两侧的滤纸的四边，避免彼此长出边缘的直接接触
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转印膜过期或不适合
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选用合适合格的转印膜
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电压或电流过大
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80-100V电压或20mA恒流
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转印的时间过短
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根据不同的转移装置保证转移的时间
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蛋白转移过程中环境过热
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应配置冷却装置，保证凝胶和膜处于20度以下
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显
色
过
程
中
无
条
带
出
现
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所使用的第一抗体、第二抗体及显色方法不合适
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选择适于目的蛋白的第一抗体；适于第一抗体的第二抗体；适于第二抗体的显色方法
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封闭液中起封闭作用的物质过浓
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降低其封闭作用物质的浓度
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目的条带含量低于一抗的检测灵敏度
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使用合适方法增加目的条带的含量
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一抗的效价低或稀释倍数过大
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增加一抗的浓度即减少稀释倍数
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二抗的效价低
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增加二抗的浓度既减少稀释倍数
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一抗或二抗的作用时间不足
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相应的增加作用时间，保证在37℃作用的时间在1h以上
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一抗或二抗后洗涤的时间和次数过长
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减少洗涤的次数和时间，以37℃，5~10min，三次为好，可酌情减量
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二抗的显色时间过长（如辣根过氧化物酶）
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如果选用的是在短时间内褪色的二抗显色法应注意避光显色时间不宜太长，显色后即拍照留图
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显
色
背
景
过
高
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封闭液中封闭物质不足
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增加起封闭作用的物质浓度
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转印膜未能完全的被封闭液所覆盖，膜上的非蛋白样品的部位暴露未能被封闭物质占据
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注意使封闭液完全的覆盖转印膜的每一部分
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封闭的时间和温度不够
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37℃下至少应轻轻振摇封闭1h以上
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一抗为多克隆抗体，与非目的蛋白条带也有作用
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适当的减少一抗的浓度和作用时间，增加洗涤次数
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二抗浓度过高洗涤不彻底
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降低二抗浓度，适当增加洗涤次数
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化学显色底物过多
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按照说明适量加入显色剂各种成分
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显
色
时
间
过
长
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一抗或二抗浓度低
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减少一抗及二抗的稀释倍数或增加作用的时间
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显色剂底物浓度不足
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增加显色剂的用量
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显色剂失效
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检查相关成分的pH制和质量
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目的条带量少于一抗检测的灵敏度
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浓缩目的蛋白或增加上样用量
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蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。
蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1)固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。2)封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。
蛋白质印迹（Western blotting）
蛋白质印迹方法是用抗体检测蛋白的重要方法之一。将蛋白质混合样品经SDS-变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳后,分离为不同条带,其中含有能与特异性抗体相应的待检测的蛋白质(抗原蛋白),将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上此过程称为blotting,以利于随后的检测能够的进行,随后,将硝酸纤维素膜膜与抗血清一起孵育,使第一抗体与待检的抗原决定簇结合(特异大蛋白条带),再与酶标的第二抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量。 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 蛋白质印迹法首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片硝酸纤维素膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。
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