花卉组培苗生产技术规程
1 范围
本技术规程规定了河北省主要花卉组培苗生产环境的消毒灭菌、培养条件调控以及组培苗接种、继代、生根、移栽等的技术操作程序，并对其生产、试验设备、设施提出了具体要求。
本技术规程适用于河北省盆花和切花组培苗生产。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
2.1 花卉
凡是具有一定观花、观叶、观芽、观茎、观果和观根等观赏价值，并经过技术和艺术进行栽培和养护的植物。
2.2 植物组织培养
是指在无菌条件下，将离体的植物器官（如根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（如形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使它们得以继续生长、分化、形成完整植株的过程。
2.3 花卉组培苗
以植物组织培养方法进行繁殖的花卉苗木称花卉组培苗。
2.4 植物生长物质
指一些调节植物生长发育的物质。包括植物激素和植物生长调节剂。
2.5 外植体
用于组织培养的组织、器官、细胞及原生质体称为外植体。
2.6 培养材料
生长在培养容器内培养基上的植物材料统称培养材料。
2.7 培养基
在植物组织培养过程中，由人工配制的提供培养材料生长所必需的营养元素和某些生理活性物质的基质。
2.8 接种
将外植体经消毒灭菌后，在无菌条件下放入培养容器内培养基上的过程。
2.9 增殖
指外植体或继代组培苗产生出新的具有特定结构和功能的组织或器官的现象。
2.10 继代
是指培养过程中将培养材料周期性地分株、分割、剪截等转接于新鲜培养基上进行增殖的过程。
3 生产设备（施）及化学试剂
3.1 生产设备（施）
3.1.1 建筑设施
设计组培实验室或小型组培工厂必须选择环境优静、无污染的地方并保证其生产过程中不对周围环境造成污染。实验室或小型组培工厂各部分的配置要合理，做到工作方便、使用安全、节省能源。房屋设计包括准备室、接种室、培养室、洗涤室、实验室、贮存室、温室，另外还可配置办公室、更衣室等。
3.1.2 生产设备
3.1.2.1 洗涤设备
工厂化生产可选用自动或半自动洗瓶机，实验室或小型车间选用普通洗涤用具，如洗涤室水槽、塑料盆、塑料桶、塑料箱等，人工洗涤。另外配置干燥箱、晾瓶架等。
3.1.2.2 灭菌设备
高压蒸汽灭菌锅（大型卧式、中型立式、小型手提式））、器械消毒器、紫外灯、烘干箱、微滤孔器等。
3.1.2.3 接种设备及工具
超净工作台、镊子、剪刀、解剖刀、接种针、钢丝架、酒精灯等。
3.1.2.4 培养设备
培养容器（三角瓶、罐头瓶、专制塑料瓶、试管等）、培养架、振荡和旋转培养机、空调、光照培养箱等。
3.1.2.5 实验设备
冰箱、蒸馏水器、电子天平、架盘天平、pH 5.0～7.0精密试纸、酸度计、温湿度表、照度计、盛装器皿（烧杯、试剂瓶等）、计量器皿（量筒、容量瓶、移液管等）以及其他实验室常用器具等。
3.1.2.6 细胞学观察设备
体视显微镜、解剖镜、高倍显微镜，有条件的还可购置显微照相设备、测微尺等。
3.2 常用化学试剂
3.2.1 洗涤剂
选用无污染洗衣粉、洗洁精、去污粉等。
3.2.2 灭菌剂
选用酒精、氯化汞、次氯酸钠、高锰酸钾、甲醛、过氧乙酸、新洁尔灭、来苏水、抗菌素等。
3.2.3 无机盐类和有机物类
常用培养基如MS、B5、N6等大量元素和微量元素所规定的无机盐类和有机物类；或者根据试管苗生产所用培养基种类购置所需化学试剂。常见培养基成分见附录A。
3.2.4 植物生长物质
细胞分裂素：6～苄基氨基嘌呤（6～BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）、2～异戊烯腺嘌呤（2ip）等。
细胞生长素：吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、2,4～二氯苯氧乙酸(2,4～D)等。
赤霉素：GA3等。
乙烯：C2H4。
3.2.5 碳水化合物
蔗糖或食用砂糖。
3.2.6 固化剂
可选用以下任何一种：组培专用培养基固化剂、微生物多糖固化剂、琼脂等。
3.2.7 培养基附加成分
为促进试管苗的生长，有时培养基中还可加入以下附加成分，氨基酸、水解乳蛋白（LH）300mg/L～500mg/L、水解酪蛋白（CH）200mg/L～500mg/L以及腺嘌呤(ADE)1mg/L～80mg/L等。
4 消毒灭菌操作规程
4.1 洗涤室的消毒灭菌
每天用来苏水、过氧乙酸等喷洒地面，保持室内清洁。
4.2 接种室的消毒灭菌
接种前用紫外灯照射20min～30min，并定期(一般7d)用高锰酸钾及甲醛混合薰蒸。
4.3 培养室的消毒灭菌
一般7d左右用高锰酸钾及甲醛混合薰蒸，或用70％酒精喷雾消毒，也可选用广普性杀菌烟雾剂薰蒸。
4.4 超净工作台的消毒灭菌
接种前用紫外灯照射20min～30min，并用70％酒精喷洒台面，或用新洁尔灭擦拭台面；定期清洗超净工作台过滤膜以保证过滤膜清洁。
4.5 培养基的消毒灭菌
高温高压蒸汽消毒，通常在压力1.1kg/cm2、温度121℃条件下保持15min～20min即可。
4.6 接种器具的消毒灭菌
使用前进行蒸气消毒；接种过程中采用小型灭菌器或用酒精灯灼烧消毒。
4.7 污染的瓶苗消毒灭菌
用消毒锅高温高压消毒，然后再清洗培养容器。
5 培养室环境调控
5.1 温度
培养室温度应控制在25℃±2℃；可根据培养物所需的最适温度进行调节。
5.2 湿度
培养室保持70％～80％的相对湿度。
5.3 光照
一般培养室光照强度控制在1500lx～3000lx，可根据培养物的需光特性调整光照强度；工厂化生产时，为降低成本可考虑利用自然光照。
6 组培苗生产操作规程
6.1 培养基的配制
6.1.1 培养基选择
根据培养材料生长发育特性选择合适的基本培养基种类和激素配比。（常见培养基见附录A）。
6.1.2 母液的配制和保存
6.1.2.1 母液的配制
根据生产情况，母液可以配制成单一化合物母液，也可以配制成几种化合物的混合母液。大量元素母液配制50倍，微量元素母液配制100倍，植物生长物质配制浓度0.5mg/ml～1.0mg/ml，植物生长物质的配制方法见附录B。
6.1.2.2 母液的保存
母液配制好后，存放4℃的冰箱中。
6.1.3 培养基配制程序
准备好母液、蒸馏水、蔗糖、固化剂等，按以下程序制作。
6.2 培养材料及消毒
6.2.1 培养材料的选择和确定
可以选取生长健壮、无病虫害、能保证原品种优良性状的植物体的任何部位，如茎尖、茎段、叶片等，还可根据需要，采用根、花瓣、鳞茎、花粉、花药等部位来培养。
6.2.2 外植体的消毒灭菌
消毒液种类、浓度及消毒时间的长短需根据材料种类、部位及老、嫩程度确定，以达到最佳的消毒效果。可以根据材料部位选择以下方法：
①茎尖、茎段及叶片等的消毒：70%酒精浸泡数秒钟，无菌水冲洗2次～3次，再用0.5%～2%的次氯酸钠浸泡10min～15min，用无菌水冲洗3次后接种；
②种子的消毒：70％酒精迅速漂洗一下，果实用2％的次氯酸钠浸泡10min，无菌水冲洗2次～3次后接种果实内的种子或组织；种子先用0.5％～2％的次氯酸钠浸泡20min～30min或用0.1％的升汞消毒0.5min～5min，用无菌水冲洗3次后接种。
③根及地下部器官的消毒：0.1％～0.2％的升汞消毒5min～10min,或用2％的次氯酸钠浸泡10min～15min,然后用无菌水冲洗3次～5次后接种。
6.3 初代培养
6.3.1 初代（诱导）培养基
1/3MS + 6-BA0.2mg/L + IBA0.02mg/L为花卉组培苗常用初代培养基之一。可以根据培养的植物种类、接种部位具体调整。
6.3.2 外植体的接种
培养材料经过消毒后，在无菌滤纸上切割成所需大小，然后进行接种。
6.4 组培苗的增殖与继代培养
培养材料的增殖类型最好采用侧芽和丛生芽增殖类型。在培养基中添加植物生长物质是组培苗增殖的主要手段，植物生长物质的使用浓度和作用参见附录B。组培苗的不断增殖通过周期性的继代培养来实现，继代培养周期根据培养苗种类及生长情况而定，一般30d继代1次，亦可根据需要20d～90d继代1次。
6.5 组培苗生根
6.5.1 瓶内生根
6.5.1.1 生根材料的选择
在继代培养的组培苗中剪取或切取生长健壮、叶色正常、叶片舒展、适于生根的无根苗，接种在生根培养基上进行生根培养。
6.5.1.2 诱导生根
采用生长素诱导组培苗生根，一般使用种类和浓度参见附录B。极难生根的植物可采用二步生根法，第一步采用附加高浓度生长素的培养基诱导根原基的形成，第二步采用无激素的培养基诱导根的伸长。采用二步生根法时第一步通常黑暗培养，第二步需要光照培养。
6.5.2 瓶外生根
6.5.2.1 瓶内诱导瓶外生根
无根苗接种到生根培养基上，当基部出现突起，即根原基形成后，直接炼苗移栽，使根的伸长在基质中进行。
6.5.2.2 瓶外生根（微扦插）
把继代培养的组培苗作为微型插条，用一定浓度的生长素如NAA、IBA或ABT生根粉（一般100ppm～800ppm）速蘸或浸泡，扦插到消毒后的无土基质中，基质多采用蛭石、草炭、珍珠岩或混合基质等。注意温度、湿度等环境条件，初期相对湿度要求高于90％，以后逐渐降低相对湿度在60％～80％之间。
6.6 组培苗炼苗移栽
6.6.1 组培苗炼苗
组培苗在移栽前将培养瓶放置温室自然散射光下，温度控制在25℃±3℃，闭口炼苗7d左右，去掉瓶盖再炼苗3d～5d，然后再移栽。
6.6.2 组培苗移栽
用镊子将生根苗从培养瓶中取出，洗去基部培养基，在800倍多菌灵溶液中浸泡30min后移栽到基质中。基质采用蛭石、草炭、珍珠岩或混合基质等。控制温度25℃±2℃，相对湿度前期80％～90％，以后逐渐降低湿度。当试管苗根系发达、形成侧须根以后，可以移栽到营养钵中，成为容器苗。
6.7 移栽苗管理
6.7.1 肥、水管理
组培苗移栽7d后开始喷施专用营养液，也可以喷施N～P～K比例为1∶1∶2的复合肥营养液，浓度一般不高于0.5‰，施肥浓度可随着苗龄的增加适当加大；基质不宜太湿，以攥在手中指间不滴水为原则，喷水与施肥相结合。
6.7.2 病虫害防治
a) 温室使用前彻底消毒，用硫磺、百菌清烟雾剂熏蒸3～4次，温室使用后经常用福尔马林、来苏水消毒。
b) 加强通风，每隔7d喷一次广普性杀菌剂。
c) 一旦发现虫害、病害及时药物治疗。
附录A
（资料性附录）
常用培养基成分表（单位：mg/L）
|
培养基成分 |
Murashige 和 Skoog (MS) (1962) |
Gamborg
(B5) (1968) |
朱至清
(N6) (1975) |
Linsmaier 和Skoog （LS） (1965) |
Chee 和 Pool (C2D) (1980) |
赵惠祥
(ASH) (1986) |
曹孜义等
(GS) (1986) |
|
(NH4)2SO4 NH4NO3 KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2PO4 NaH2PO4·H2O Na2HPO4 Ca(NO3)2·4H2O |
1650 1900 440 370 170
|
134
2500 150 250
150 |
463
2830 166 185 400 |
1650 1900 400 370 170 |
1650 1900
370 170
709 |
825 925 220 185 85 |
67
1250 150 125
175 |
|
Na2~EDTA FeSO4·7H2O Fe~EDTA |
37.3 27.8 |
37.3 27.8 |
37.3 27.8 |
37.3 27.8 |
37.3 27.8
|
2.5ml |
18.65 13.9 |
|
MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O H3BO3 KI Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O |
22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 |
10 2.0 3.0 0.75 0.25 0.025 0.025 |
4.4 3.8 1.6 0.8 |
22.3 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 |
0.85 8.6 6.2
0.25 0.025 0.025 |
2.23 1.05 0.62 0.083 0.025 0.0025 0.0025 |
1.0 1.5 0.375
0.0125 0.0125 |
|
VB1 烟酸 VB6 肌醇 甘氨酸 泛酸钙 |
0.1 0.5 0.5 100 2.0
|
10 1.0 1.0 100
|
1 0.5 0.5
2 |
0.4
100
|
3 8 5 55.5
0.5 |
0.04 0.05 0.05 10 0.2 |
10 1 1 25
|
|
蔗糖 |
30000 |
20000 |
50000 |
30000 |
30000 |
15000 |
15000 |
|
pH |
5.8 |
5.5 |
5.8 |
5.8 |
5.7 |
5.8 |
5.9 |
附录B
（资料性附录）
常用植物生长物质（单位：mg/L）
|
类 别 |
种 类 |
配制方法 |
常用浓度(mg/L) |
功 能 |
|
细胞分裂素 |
6～BA |
先用少量0.5N～1.0N的盐酸（HCl）溶解，然后加蒸馏水定容。 |
0.1～2.0 |
促进细胞分裂与扩大，诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长，抑制顶端优势；常与生长素配合使用，用以调节细胞分裂、细胞伸长、细胞分化和器官形成。 |
|
KT |
0.05～2.0 |
|||
|
ZT |
0.05～2.0 |
|||
|
2ip |
0.05～2.0 |
|||
|
生长素 |
IAA |
先用少量1.0N的KOH或NaOH溶解，然后加蒸馏水定容。 |
0.1～1.0 |
促进细胞伸长生长和细胞分裂 |
|
0.5～5.0 |
促进不定根和侧根形成 | |||
|
IBA |
0.05～1.0 |
促进细胞伸长生长和细胞分裂 | ||
|
0.2～5.0 |
促进不定根和侧根形成 | |||
|
NAA |
0.01～0.5 |
促进细胞生长和扩大 | ||
|
0.2～2.0 |
促进生根 | |||
|
2,4～D |
0.01～0.5 |
诱导愈伤组织和胚状体的产生 | ||
|
赤霉素 |
GA3 |
先用少量酒精溶解，然后加水定容。 |
0.0～0.2 |
诱导细胞伸长生长 |
|
乙烯 |
C2H4 |
―― |
―― |
促进芽的诱导和生长 |
