6月15日卢先生原核表达知识讲座部分问答实录

本来准备将讲座中问答环节的内容整理成问答后发布，但考虑到问答环节中有许多秀友参与了讨论，为保证连贯性，现直接将问答过程列出，供未能参加的讲座的秀友参考。 主讲卢先生(1137954285)22:00:03 回来了 主讲卢先生(1137954285)22:00:08 半小时 主讲卢先生(1137954285)22:00:14 回答不了的，改天 主讲卢先生(1137954285)22:04:00 无--忧(383445963) 21:28:03 如果用某个载体，蛋白不表达的话，又什么表现？还有，碰到这种情况该如何解决 主讲卢先生(1137954285)22:04:19 一般来说，蛋白不表达分两种情况 主讲卢先生(1137954285)22:04:48 一种是你的载体构建环节出了问题 主讲卢先生(1137954285)22:05:36 这个你要查查看，你的基因合成是否出现碱基的缺失，移码 主讲卢先生(1137954285)22:05:47 导致翻译没进行，或终止 主讲卢先生(1137954285)22:06:18 或者你的鉴定出现假阳性 无--忧(383445963)22:07:05 鉴定过都是正确的，测序也是对的 O(261566962)22:07:11 这个测序不就可以鉴定了吗 主讲卢先生(1137954285)22:07:21 第二种情况 主讲卢先生(1137954285)22:07:45 在前期构建阶段没有任何问题的，那么就要考虑 无--忧(383445963)22:08:14 考虑什么啊 主讲卢先生(1137954285)22:08:25 第一，是否是由于你的基因结构问题，导致你的基因在大肠杆菌中转录效率非常之低 主讲卢先生(1137954285)22:08:45 比如有许多密码子不是大仓杆菌偏爱的 O(261566962)22:08:47 稀有密码子   似水无痕(307158989)22:09:18 换宿主菌 Rosetta あ风の逍遥あ(823073212)22:09:17 还有一个mRNA是否形成二级结构 ~O(∩_∩)O~(514841680)22:09:24 怎样防止移码突变呢？是不是只要把你要表达的蛋白的全长cDNA克隆下来就行呢？ 主讲卢先生(1137954285)22:09:45 遇到这种情况，你可以考虑做一些突变 主讲卢先生(1137954285)22:10:01 或者选用一些特种表达菌株 主讲卢先生(1137954285)22:10:11 具体的请大家参阅 主讲卢先生(1137954285)22:10:26 pET表达手册 主讲卢先生(1137954285)22:11:07 生物秀上有的 あ风の逍遥あ(823073212)22:11:15 不是那个如果转录出来的mRNA形成二级结构的话，尤其是在5'端，那个蛋白也不会表达吗？ 主讲卢先生(1137954285)22:11:59 这个不是绝对的 主讲卢先生(1137954285)22:12:03 请问一下卢先生一下几个问题 1、膜蛋白的表达在选择载体上是否有一定的规律可循 2、我表达的一个蛋白诱导表达后产生的是一个比原蛋白要小很多的片段，但是在构建载体的过程中，并没有移码突变和终止密码子突变，采用什么样的方法可以诱导出正确的蛋白 3、枯草芽孢杆菌表达系统和大肠杆菌表达系统的区别有哪些？在什么情况下偏向于优先选择枯草表达系统 主讲卢先生(1137954285)22:12:34 这个问题比较长，你发到我QQ 主讲卢先生(1137954285)22:12:42 我明天回答你 主讲卢先生(1137954285)22:12:56 飛肥(408098529) 21:28:55 IPTG对于蓝白斑的筛选有没很大的影响？ 主讲卢先生(1137954285)22:13:05 有影响 主讲卢先生(1137954285)22:13:12 要控制浓度 主讲卢先生(1137954285)22:13:31 不能太高，太高可能导致科龙无法生长 主讲卢先生(1137954285)22:14:02 某个基因是在肝中表达的，如果我把这种基因构建载体后，然后养肝细胞，把表达载体转到肝细胞中，行不行？ 主讲卢先生(1137954285)22:14:13 你可以用穿梭载体 主讲卢先生(1137954285)22:14:19 真核表达 主讲卢先生(1137954285)22:14:50 一般来说，正常动物细胞不适合做表达 主讲卢先生(1137954285)22:15:26 一般选用癌细胞或者低分化细胞作为表达系统 主讲卢先生(1137954285)22:15:43 我是右撇子(524695276) 21:30:44 我做的胶染色后在脱色 发现胶的下半部分有白色雪花状绿豆大小的斑点！想问问 是那出问题了 主讲卢先生(1137954285)22:16:32 我也遇到过 主讲卢先生(1137954285)22:16:53 你把溴酚蓝跑到胶外在染色看看 主讲卢先生(1137954285)22:17:09 cat(286361894) 21:30:52 长片段连接时 片段和载体怎么处理好？ 主讲卢先生(1137954285)22:17:24 我不知道你所谓的长片段是多长 主讲卢先生(1137954285)22:17:39 如果是大于1000的 代谢工程(285459331)22:17:40 7000多呢 主讲卢先生(1137954285)22:18:15 打错了大于2000的 代谢工程(285459331)22:18:11 一个操纵子 代谢工程(285459331)22:18:20 恩 cat(286361894)22:18:41 片段7000载体3000 cat(286361894)22:18:51 片段是一个操纵子 ぐ點到即止(43729572)22:18:52 卢先生你好 我想请问一下芽孢杆菌表达系统中常用的宿主和载体有哪些？以及怎样得到这方面的资料呢？谢谢 主讲卢先生(1137954285)22:19:23 一般采用低温连接 主讲卢先生(1137954285)22:19:27 比如4度 主讲卢先生(1137954285)22:19:33 延长时间 主讲卢先生(1137954285)22:19:41 比如至24小时 O(261566962)22:19:31 4度也可以做酶连的啊？ 主讲卢先生(1137954285)22:19:54 提高片段与载体比例 主讲卢先生(1137954285)22:20:05 加入稳定剂 cat(286361894)22:20:21 主要是在连接出问题吗 主讲卢先生(1137954285)22:20:31 无--忧(383445963) 21:32:55 还有，做蓝白斑筛选时，总是全是白斑，这究竟是为什么呢 主讲卢先生(1137954285)22:20:45 你挑白斑做鉴定了么 主讲卢先生(1137954285)22:20:49 什么结果 主讲卢先生(1137954285)22:21:10 泡(1024780226) 21:34:42 为什么PET带有的目的基因有表达，而pBAD带有的另一目的基因没有表达，这两个质粒在同一表达菌株中 无--忧(383445963)22:21:05 做了，阳性 主讲卢先生(1137954285)22:21:32 那就是你的转化效率特别高 无--忧(383445963)22:21:46 但是有的白斑是阴性的啊 主讲卢先生(1137954285)22:22:02 TA克隆的插入能达到98% 无--忧(383445963)22:22:00 不是全部都是阳性的 O(261566962)22:22:02 我觉得是显色不完全吧？ 主讲卢先生(1137954285)22:22:13 那是两种情况 cat(286361894)22:22:06 主讲卢先生(1137954285)  22:19:54 提高片段与载体比例 主讲卢先生(1137954285)  22:20:05 加入稳定剂 是否考虑载体的比例多点呢 加稳定剂？ 主讲卢先生(1137954285)22:22:42 一种是你的板子IPTG加多了 O(261566962)22:21:47 上一个问题 稳定剂一般是什么 主讲卢先生(1137954285)22:22:53 导致背景很深 主讲卢先生(1137954285)22:23:00 无法分辨蓝白 主讲卢先生(1137954285)22:23:15 植物分子(303642932) 21:34:47 我想问下 表达菌株该如何保存？ 主讲卢先生(1137954285)22:23:26 加16-20%甘油 无--忧(383445963)22:23:22 那IPTG一般加多少合适啊 主讲卢先生(1137954285)22:23:30 -20 主讲卢先生(1137954285)22:23:50 笨小孩(404965700) 21:35:02 有一次蓝白斑筛选，蓝斑提不出质粒是怎么回事？ 灯泡(1024780226)22:23:43 泡(1024780226) 21:34:42 为什么PET带有的目的基因有表达，而pBAD带有的另一目的基因没有表达，这两个质粒在同一表达菌株中 灯泡(1024780226)22:23:49 怎么没回答呢 主讲卢先生(1137954285)22:24:02 这个问题有很多原因 主讲卢先生(1137954285)22:24:28 可能是你的质粒丢失，也有可能你提取过程中 主讲卢先生(1137954285)22:24:37 出了 问题 主讲卢先生(1137954285)22:24:47 一片落叶(157272557) 21:35:36 PCR用什么酶扩基因比较好呢？如何保证基因不会突变 主讲卢先生(1137954285)22:24:51 高保真酶 主讲卢先生(1137954285)22:25:06 循环不要大于30 主讲卢先生(1137954285)22:25:19 博弈(280684201) 21:36:36 原核载体的构建是酶切位点后紧接着就是一个基因的起始密码子如ATG吗？酶切位点与ATG之间能有其他非3的整数倍的碱基吗？ 主讲卢先生(1137954285)22:26:08 如果你的基因从ATG开始，请选用载体的ATG酶切位点 主讲卢先生(1137954285)22:26:21 这样保证你的翻译不引入外源基因 木鱼(1150832936)22:26:16 哦   主讲卢先生(1137954285)22:26:34 编码框内必须是3的倍数 博弈(280684201)22:26:55 请选用载体的ATG酶切位点？ 主讲卢先生(1137954285)22:27:06 似水无痕(307158989) 21:36:57 我表达的蛋白有130KD,带GST标签，过柱纯化后明显有2条带，目标带很淡，而GST很浓，我想问GST怎么除掉？ 主讲卢先生(1137954285)22:27:26 对， 主讲卢先生(1137954285)22:27:36 比如NDE1   主讲卢先生(1137954285)22:27:40 NCO 1 主讲卢先生(1137954285)22:28:02 载体上开始编码的位置的酶切位点 主讲卢先生(1137954285)22:28:14 你是亲和层析 主讲卢先生(1137954285)22:28:22 还需要优化纯化条件爱 似水无痕(307158989)22:28:28 做过梯度洗脱 似水无痕(307158989)22:28:34 还是一样 主讲卢先生(1137954285)22:28:44 GST标签去除有酶 主讲卢先生(1137954285)22:29:04 你可以考虑亲和以后做一个离子交换 似水无痕(307158989)22:29:15 还有别的办法吗 主讲卢先生(1137954285)22:29:25 或者分子筛 似水无痕(307158989)22:29:30 怎么会有GST那么浓 主讲卢先生(1137954285)22:29:41 或者再过一次亲和柱 主讲卢先生(1137954285)22:30:03 好了，我太累了 主讲卢先生(1137954285)22:30:11 大家的问题我明天继续吧 主讲卢先生(1137954285)22:30:26 你们有什么问题继续发