摘要: 本文主要介绍了用于基因组文库的真核DNA的部分酶切之预反应的实验方法.
材料: 缓冲液和溶液:蔗糖凝胶上样缓冲液;Tris-Cl(10mmol/L,ph8.0); 酶和缓冲液:限制性内切核酸酶; 凝胶:琼脂糖凝胶;琼脂糖凝胶(0.6),用0.5*TBE,含有0.5ug/ml的溴化乙锭.琼脂糖凝胶,用于脉冲场凝胶电泳 核酸和寡核苷酸:基因组DNA,高分子质量;λ噬菌体DNA和质粒寡聚体 专用设备:毛细管,封口透析袋;煮过预置于70℃的水浴;宽口移液尖头 方法: 1、利用将被用于制备克隆片段的同一份基因组DNA建立预实验. A、将30ug高分子质量真核DNA用10mmol/L Tris-Cl(ph8.0)稀释至900ul,加入100ul适当的10*限制酶缓冲液. B、用一个封口的玻璃毛细管将溶液轻轻混匀,确保高分子质量DNA已完全均匀地分布于限制酶缓冲液中. C、混匀后,将稀释DNA于室温放置1h,使残余的DNA聚集块能彻底地解散. 2、用1至10标记微量离心管.用一宽口的玻璃毛细管或一次性塑料移液器尖头将60ulDNA溶液转移至一微量离心管中(第1管).转移30ulDNA溶液至其他标记的9个微量离心管中.冰浴放置. 3、加2单位适当的限制酶至第1管中. 4、用一新鲜的移液尖头将第1管中30ul反应液转移至系列离心管的第2管内.如前所述混匀,继续转移至下一个离心管中.在第10管中不加任何东西(无酶对照),同时从第9管中取出30ul舍弃. 5、37℃温育1h. 6、70℃加热15min,使酶失活. 7、将反应冷却至室温,加入适当量的蔗糖凝胶上样缓冲液. 8、用宽口塑料移液尖头或一次性玻璃毛细管将溶液转移至0.6%琼脂糖凝胶的点样孔内,更好的是转移至脉冲场凝胶电泳的上样槽中,随后进行电泳. 9、将消耗的真核DNA大小与含λ噬菌体和质粒寡聚体的DNA标准进行比较.鉴别能获得大量理想大小基因组DNA的部分酶切条件.
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