FASTX-Toolkit
The FASTX-Toolkit is a collection of command line tools for Short-Reads FASTA/FASTQ files preprocessing.
Next-Generation sequencing machines usually produce FASTA or FASTQ
files, containing multiple short-reads sequences (possibly with quality
information).
The main processing of such FASTA/FASTQ files is mapping (aka aligning)
the sequences to reference genomes or other databases using specialized
programs. Example of such mapping programs are:
Blat,
SHRiMP,
LastZ,
MAQ
and many many others.
However,
It is sometimes more productive to preprocess the FASTA/FASTQ files before
mapping the sequences to the genome - manipulating the sequences to
produce better mapping results.
The FASTX-Toolkit tools perform some of these preprocessing tasks. http://hannonlab./fastx_toolkit/index.html
安装说明书：http://hannonlab./fastx_toolkit/install_ubuntu.txt 或者下编译好的包直接使用，无须安装
FastQC
A quality control tool for high throughput sequence data.
http://www.bioinformatics./projects/fastqc
TopHat (junction site)
SAMtools（calling SNP）
Bowtie (mapping reads to ref genome) 1.bowtie:短序列比对的新工具（转） 1.Bowtie是一个超级快速的，较为节省内存的短序列拼接至模板基因组的工具。它在拼接35碱基长度的序列时，可以达到每小时2.5亿次的拼接速度。
Bowtie并不是一个简单的拼接工具，它不同于Blast等。它适合的工作是将小序列比对至大基因组上去。它最长能读取1024个碱基的片段。换言之，bowtie非常适合下一代测序技术。
在使用bowtie前，需要使用bowtie-build来构建比对模板。如果你需要比对是比较常见的基因组的话，你可以去http://bowtie-bio./manual.shtml下载你所需要的Pre-built
indexes文件就可以了。
如前所述，bowtie适合于将短序列拼接至大的模板上，尤其是基因组。模板最小尺寸不能小于1024碱基，而短序列最长而不能超过1024碱基。Bowtie设计思路是，1）短序列在基因组上至少有一处最适匹配，
2）大部分的短序列的质量是比较高，3）短序列在基因组上最适匹配的位置最好只有一处。这些标准基本上和RNA-seq,
ChIP-seq以及其它一些正在兴起的测序技术或者再测序技术的要求一致。
如果bowtie在你的机器上运行起来很慢，那么你可以试试以下的一些办法来让它跑得快一些：
- 尽可能的使用64位bowtie。很显然，64位运算会比32位运算更快。所以最好使用支持64位运算的计算机来运行64位的bowtie。如果你是从原文件开始编译程序，在g++编译时，你需要传递-m64参数，你也可以在make的时候加入这一信息，比如说传递BITS=64给make，具体的：make
BITS=64 bowtie。想知道你自己运算的是什么版本的bowtie，你可以运行bowtie –version
- 如果你的计算机有多个CPU或者CPU内核，那么请使用-p参数。-p参数会让bowtie进入多线程模式。每一个线程都会使用单独的CPU或者CPU内核。这种并行的运算模式也会大大加快运算速度。
- 如果你的报告文件中每条短序列都有太多的匹配位点（超过10）那么你可以试着重新使用bowtie-build加上
–offrate参数，如bowtie-build –offrate
4。-o/–offrate默认值为5，每下降1，比对速度会增加1倍，但是系统消耗（硬盘空间和内存）也会加倍。
- 如果你的系统配置太低，比如内存不足4GB，那么建议你在bowtie的时候使用–offrate参数。与上一条相反的，你需要加大offrate的值。bowtie
–offrate 6. 其默认值为5。每增加1，内存空间的要求下降，这样会减少读取硬盘当中虚拟内存的次数，速度反而会有所上升。
-n模式与-v模式。
默认的，bowtie采用了和Maq一样的质量控制策略，设置 -n 2 -l 28 -e 70。总的来说，比对模式分为两种，一种是 -n 模式， 一种是
-v 模式，而且这两种模式是不能同时使用的。bowtie默认使用-n模式。
-n模式参数： -n N -l L -e E
其中Ｎ，Ｌ，Ｅ都为整数。-n N 代表在高保真区内错配不能超过Ｎ个，可以是0?3，一般的设置为2。-l
L代表序列高保真区的长度，最短不能少于5，对于短序列长度为32的，设置为28就很不错。-e E代表在错配位点Phred
quality值不能超过E，默认值为40。Phred
quality值的计算式为：-10 log(P,base(10))
| Phred Quality值 |
错配可能性 |
正配可能性 |
| 10 |
1/10 |
90％ |
| 20 |
1/100 |
99％ |
| 30 |
1/1000 |
99.9％ |
| 40 |
1/10000 |
99.99% |
| 50 |
1/100000 |
99.999% |
而-v模式的参数相对较少。
-v模式参数：-v V
其中V为整数。-v V代表全长错配不能超过Ｖ个，可以是0?3。这时，不考虑是否高保真区，也不考虑Phred quality值。
–best 与–strata
–best参数代表报告文件中，每个短序列的匹配结果将按匹配质量由高到低排序。–strata参数必须与–best参数一起使用，其作用是只报告质量最高的那部分。所谓质量高低，其实就是指错配的碱基数，如果指定了-l
L参数，那就是在高保真区内的错配数，否则就是全序列的错配数。如果你还指定了 -M X的话，那就会在质量最高的当中，随机选择X个来报告。也就是说，当我们指定了-M
1 –best –strata的话，那就只报告1个最好的。
对于输入，-q是指输入的文件为FASTQ(文件扩展名通常为.fq或者.fastq)格式；-f是指输入文件为FASTA(文件扩展名通常为.fa,
.mfa或者.fna)格式；-c是指在命令行直接输入要比对的序列。
下面就是一个具体的例子：
bowtie -v 2 -M 1 –best –strata Genomes/hg19_ebwt/hg19 Pol2ChIP.fastq
Pol2ChIP.map
2.本人用过的短序列比对工具里，感觉bowtie最好使，大体用法和blast挺像的，也很简单，就两步：
第一步，build：感觉和blast的第一步formatdb差不多，在命令行输入bowtie-build
<seqfile>
<dbname>
第二步，align：和blast的核心（blastall）差不多，在命令行输入：bowtie [options]*
<dbname> <short_reads_file> <outfile>
bowtie的速度比Maq和SOAP都快，PC机上也能胜任大规模数据分析，一般100M大小的基因组做mapping，2-3min就可以了，快的让我不敢接受，呵呵，bwt算法就是牛！
bowtie的用途不仅仅是短序列比对最mapping，更多信息请参考：
http://bowtie-bio./index.shtml
本軟體目前安裝於BIP2(140.123.126.234)主機, 實驗帳號為Bioinfo 若有需要利用此軟體進行實驗,
請與 冠宏/盈達 聯絡索取實驗帳號資料
軟體目錄目標路徑: /home/bioinfo/alignmentTool/bowtie-0.12.3
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Building a new index
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Performing alignments
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Finding variations with SAMtools
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Reference genome data (*.fa)
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NGS Short reads data (*.fastq)
# bowtie-build [options]* <reference_in> <ebwt_base>
# bowtie [options]* <ebwt> {-1 <m1> -2 <m2> | --12 <r> | <s>} [<hit>]
# bowtie -S -a -f -C -p 7 <reference-index> <singleRead.csfasta> -Q <singleRead.qual> > <alignResult.sam> -S :輸出為sam檔 -a :把所有對到的read列出來，即使有multiple mapping -C :input為.csfasta -Q :.csfasta 內容裡無 quality value，所以需準備 .qual -f :伴隨 -Q -C 參數 -p int :用幾顆cpu跑
> http:///forums/showthread.php?t=6522
# bowtie -S e_coli reads/e_coli_10000snp.fq ec_snp.sam
# samtools view -bS -o ec_snp.bam ec_snp.sam
# samtools sort ec_snp.bam ec_snp.sorted
# samtools merge <out.bam> <in.bam> | <in.bam> …
# samtools pileup -cv -f genomes/NC_008253.fna ec_snp.sorted.bam
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http://ged./angus/tutorials-2011/snp_tutorial.html
http://bowtie-bio./index.shtml
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