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最近疾控人的朋友圈里只有2个字“加班！” 冬天又来了，千千万万疾控人还在寒冬里奔波，为了守护万家灯火里的那一点宁静。 笔者和小伙伴们也同样战斗在另一条加班的战线上 坚持！再坚持！ 对于我们共同的敌人，新冠，高通量技术是实验室里除RT-PCR外最常用的分型方法。 我们如何开展新冠样本的测序数据分析呢？笔者借自身一点体会与各位同行共同探讨。 分析前期准备： （1）完成测序实验。实验方法可参照前贴：新型冠状病毒测序技术路线解析 （2）准备好分析用服务器和相关软件。软件的安装和部署，可参照前贴：善用Bioconda，管理好自己的Linux工具库 （3）下载参考基因组: https://www.ncbi.nlm./search/all/?term=GCA_009948465 分析开始： 第一步：测序数据质控 质控工具：fastqc 命令运行方式 fastqc input.fastq.gz #input.fastq.gz为你的测序下机数据，可以为1个，也可以为多个文件报告查看，请参考前贴为什么我的测序质控会报错！？ 第二步：测序数据与参考基因组比对 （关键！） 比对工具: bowtie2/samtools/bcftools （注意：类似的工具很多。笔者只分析自己比较习惯用的。大家可根据自身需要选择。） 命令运行方式 bowtie2-build Ref.fa Ref.fa #Ref.fa为提前下载的新冠参考基因组。bowtie2 -U Input.fastq -S Input.sam -x Ref.fa #Input.fastq 为你的测序下机数据；Input.sam为输出文件；Ref.fa为提前下载的新冠参考基因组；此步操作为序列比对samtools sort -@ 4 -O bam -o Input.bam Input.sam #此步操作为格式转换，sam-》bamsamtools index Input.bambcftools mpileup -Ou -f Ref.fa Input.bam | bcftools call -mv -Ov -o Input.vcf ##Input.vcf为输出的snp列表查找所得的SNP意义，可通过GISAID网站查看 网址如下（需注册）：https://www./epi3/frontend# SNP位点的意义见上图左上角标注 需要注意的是：该数据库更新很快，建议及时更新。 笔者去年写过关于该数据库的介绍(新型冠状病毒分型学习笔记(1) GISAID分型)，现在型别已经更多啦~ 第三步：图形化查看比对结果（可选） 比对工具：Tablet或IGV 工具使用说明参考前贴：一图胜千言，序列比对可视化神器IGV和Tablet推荐 可直观的查看每个区域的read挂载情况，以及突变的情况。 PS: 本文所有截图都是笔者随便找的，非新冠实测数据。 第四步：基因组组装 （可选） 组装工具：Spades 具体使用方式，可参考前贴快速的细菌基因组组装软件推荐-SPAdes 命令运行方式: spades.py -1 Input_R1.fastq -2 Input_R2.fastq -o Outdir第五步：Pangolin分型（可选） Pangolin分型是GISAID分型方法之外的新冠病毒另一种分型体系。 其特定是分支间分的更为细了 https://pangolin./ 第六步：Blast查找（可选） 这里建议采用GISAID自己提供的Blast工具，其特点是不仅提供了最优比对结果，且对比对结果的地理分布和时间分布有统计，更方便开展流行病学分析。 以上基本分析结束 微微碎碎念：虽然现在市面上开始有可视化的分析软件出现，给分析工作提供了很大的方便，但由于种种原因，大多数人还是需要手工的方法去处理下机数据。且目前分析方法远没有达到sop标准。笔者借小文分享自身数据分析经验，也希望各位同行共同推进，早日将技术进一步成熟，真正实现飞速分析，标准化分析，以及人人能分析。 同时亦希望 我们每个人的微小努力，汇聚成海，护万家灯火平安。 每一天获得一点微小的收获和进步。小确幸的科研也很好。与君共勉！ |
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