本帖首发于Raindy'blog，
软件简介:
CLUSTALX－是CLUSTAL多重序列比对程序的Windows版本。Clustal X为进行多重序列和轮廓比对和分析结果提供一个整体的环境。
序列将显示屏幕的窗口中。采用多色彩的模式可以在比对中加亮保守区的特征。窗口上面的下拉菜单可让你选择传统多重比对和轮廓比对需要的所有选项。
主要功能：
你可以剪切、粘贴序列以更改比对的顺序；
你可以选择序列子集进行比对；
你可以选择比对的子排列(Sub-range)进行重新比对并可插入到原始比对中；
可执行比对质量分析，低分值片段或异常残基将以高亮显示。
当前版本:1.83
PS:如果你是新手或喜欢中文界面,推荐使用本人汉化的Clustalx 1.81版
链接地址:http://www./index.php?Go=Show::List&ID=7435 (请完整复制)
应用:Clustalx比对结果是构建系统发育树的前提
实例：植物呼肠孤病毒属外层衣壳蛋白P8(AA序列)为例
流程：载入序列―>编辑序列―>设置参数―>完全比对―>比对结果
1.载入序列：运行ClustalX，主界面窗口如下所图（图1），依次在程序上方的菜单栏选择“File”－“Load Sequence”载入待比对的序列，如图2所示，如果当前已载入序列，此时会提示是否替换现有序列(Replace existing sequences)，根据具体情形选择操作。
图1
图2
2.编辑序列：对标尺(Ruler)上方的序列进行编辑操作，主要有Cut sequences(剪切序列)、Paste sequences(粘贴)、Select All sequences(选定所有序列)，Clear sequence Selection(清除序列选定)、Search for string(搜索字串)、Remove All gaps(移除序列空位)、Remove Gap-Only Columns(仅移除选定序列的空位)
图3
3.参数设置：可以根据分析要求设置相对的比对参数。通常情况下，我们可以使用默认参数。比对参数主要有六个，分别是Reset New Gaps before Alignment(比对前重置新的空位参数)，Reset All Gaps before Alignment（比对前重置所有空位参数），Pairwise Alignment Parameters（两两序列比对参数），Multiple Alignment Parameters（多重序列比对参数），Protein Gap Parameters（蛋白空位参数），Secondary structure Parameters（二级结构参数），如图4所示：
图4
修改参数只需点击相应标签，示例比对的是多序列比对，故可选择“Multiple Alignment Parameters”弹出参数设置窗口，如图5所示：
图5
4.完全比对：返回菜单栏选择“Complete Alignment”标签，此时会弹出输出文件路径的设置窗口，设置Guide Tree File（向导树或指导树文件）、Alignment File（比对文件）的保存位置（存放路径），点击“Align”按钮程序自动开始序列的完全比对，比对所需时间因序列文件大小和长度、计算机性能而异，如图6-8所示：
图6
图7
图8
当主界面的左下状态栏会提示“CLUSTAL-Alignment File created []”时说明比全完毕，这时文件保存位置的目录下会生成生成两个文件，分别是*.aln和*.dnd，aln是序列比对的文件，可以进一步用于构树系统发育树，dnd是向导树文件（指导树），这两个文件可以用Windows系统中的“记事本”或第三方程序“UltraEdit”等打开，如：
图9 ALN文件
图10 dnd文件
5.后续分析：
1)Clustalx比对生成的结果可读性不是太好，一般需要专业的序列着色软件处理，如Boxshade、ESPript，这两个工具都是在线进行，其中Boxshade图解教程详见本Blog日志。
Boxshade在线网址：http://www.ch./software/BOX_form.html
ESPript在线网址：http://espript./ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi
2)转换ALN文件，进一步构建系统发育树，转换格式依不同软件而有所不同，如在PHYLIP分析前需要将ALN格式转换为PHY格式方可...
注意事项：
1)dnd是向导树文件，可以用TreeViews软件查看树图。注意：向导树不是系统发育树，两者区别敬请关注近期－系统发育分析专题。
2)多重比对文件推荐要求为规范的FASTA格式，文件扩展名不限，格式大致如下：
>RGDV_BAA02676
MSRQAWIETSALIECISEYGTKCSFRHLWVIMSFIAVFGRYYTVN
>RGDV_ABC75537
MSRQAWIETSALIECISEYGTKCSFCHLWVIMSFIAVFGRYYTVN
>RGDV_AAO64253
MSRQAWIETSALIERISEYGTKCSFRHLWVIMSFIAVFGRYYTVN
>RGDV_AAY14576
常见问题：
正在整理中，欢迎大家将使用过程存在的问题在此提出，以便于解答...
一点唠叨：
Clustalx的使用教程最早源自原数字基因网站长曹又方博士的·用ClustalX做多序列比对分析·一文，曹兄无私奉献未做署名。不过，网上有些人实在恶心，明明转载他人文章，居然还冠上自己大名，美其名曰原创，不是不感慨国人的“劣根性”。
