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实例 114 废啤酒酵母发酵谷胱甘肽制备 谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的活性三肽，又称为还原型谷胱甘肽（GSH )，广泛存在于生物体内，是重要的抗氧化剂，参与细胞内的多种反应。例如保护蛋白质疏基，维持其活性；防止脂质氧化、解毒、保护皮肤。临床上谷胱甘肽用于治疗肝脏疾病、有机物及重金属中毒、癌症治疗造成的药物性损伤及白内障等 谷胱甘肽的生产方法主要有生物提取法、发酵法、化学合成法及酶法等，其中发酵法是生产谷胱甘肽最具潜力的方法。 (1）工艺流程 （2）主要步骤 ① 菌种复壮 按制备FDP的方法复壮，获得纯净废啤酒酵母。 ② 配制基本发酵培养基 称取10g葡萄糖、59 MgSO4、19 K2HPO4、1g KH2PO4，在搅拌下顺序投入1L蒸馏水中溶解，然后用无菌的0.22 μm 滤膜过滤后装入容积为2L 的Biostat B灭菌发酵罐中，最后再加入100g复壮的啤酒废酵母，进行间歇发酵。 ③ 发醉培养 控制发酵罐温度为30℃、搅拌速度为300～500r/min、发酵6～9h，获得细胞内谷胱甘肽浓度为210～250mg/L的酵母细胞。 ④ 分离 将发酵液进行离心，离心速度为3500～400Or/min, 时间20min。弃上层清液，下层沉淀用2倍体积软水洗涤2次，同法离心，收集菌体提取GSH。 ⑤ 提取 将收集的发酵菌体置于烧杯中，向其中加入二甲苯，密闭后置于摇床上以20～30r/min速度处理6～7h，破坏酵母细胞膜。二甲苯用量为菌体质量的1％～2％ ( mL/g)。 处理完成后，加入蒸馏水搅拌提取3次，3000r/min离心20min，收集、合并离心上清液进行沉淀蛋白质处理。每次加水量为细胞质量的10倍，搅拌提取时间为30min。 ⑥ 除杂蛋白 在搅拌下向离心上清液中加入10％（体积分数）盐酸，调节pH值为4.2～4.5，min。静置0.5～lh, 4000r/min离心15min。收集上层清液，下层沉淀用2倍体积pH值为4.2～4.5蒸馏水洗涤，再次离心。合并两次上层清液，进行超滤处理。 将离心上清液泵入超滤器，用截留分子量6000的超滤膜进行超滤处理。处理压力为0.1～0.2MPa, 在超滤过程中，要不时加入蒸馏水，直至截留液中基本无GSH时止。 ⑦ 脱色 向超滤液中加入其体积1/10的活化NAK-12树脂，搅拌下进行脱色处理30min。过滤，获得无色的GSH提取液。 脱色后的NAK-12 树脂，用3～5倍pH值为8～9 的蒸馏水搅拌洗涤3次，每次洗涤30min, 流出液呈中性时止。洗涤后的树脂可再次用于脱色处理。 ⑧ 浓缩 将脱色液进行真空减压浓缩，直至溶液中GSH浓度为2％～5％时止。浓缩条件为真空度一0.08～一0.06MPa。 ⑨ 萃取 取1.55g磷酸二戊酯，搅拌下加入120mL正辛醇，再加入865μL 蒸馏水，搅拌30～60min，获得磷酸二戊酯浓度为0.04～0.06 moL/L、W0为10的反胶束溶液。 向浓缩液中加入KCI，调节其浓度达到0.3～0.35moL/L。将该浓缩液置于萃取装置中，控制温度为25～45℃，在搅拌下按照浓缩液：反胶束溶液（体积比）为1：(2～3）的比例加入0.04～0.06 moL/L的磷酸二戊酯反胶束，在150～300r/min 下萃取15～20min。共萃取3～5次，GSH的总萃取率为93.7％。 ⑩ 反萃取 每次萃取后，静置15min放出下层萃余液，转移至另一萃取器进行再次萃取，上层为荷载GSH的磷酸二戊酯反胶束。合并反胶束溶液，置于反萃取器中，加入同体积pH值为9～10的蒸馏水，在150～300r/min下萃取5次，直至反萃取液中无GSH时止。GSH 的总反萃取率为97.4％。 卸载GSH后的反胶束，用分子筛吸附水分、过滤除杂后可再次用于配制反胶束。 ⑾ 浓缩、脱盐 收集反萃取液，进行真空减压浓缩，直至浓缩液中可溶性固形物浓度为15％～20％时止。将浓缩液置于截留杆量200的透析膜中，对流水透析5～6h，获得脱盐溶液。 ⑿ 冻干 将脱盐溶液进行冷冻干燥，获得GSH冻干粉。冻干条件为真空度15～35Pa，温度一60～一50℃，冻干时间24h。 (3）主要指标 白色粉末，产品收得率为0.19％～0.23％, GSH含量90.7％，水分5.35％。 |
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