第6章-干细胞治疗心血管疾病新进展
干细胞移植试验性治疗临床心血管疾病已有整整10年。一路走来，成功与失败共舞，困惑和梦想齐飞。虽然我们没有达成10年前的美好愿景，但毫无疑问，近10年细胞治疗一直是心血管内科和生命科学领域的热点，目前干细胞研究的广度和深度也绝非十年前可以想象的。
骨髓细胞、间充质干细胞和其他成体干细胞、人胚胎干细胞等多种干细胞类型已成功进行了动物实验和临床研究。由于短期心功能改善显著，骨髓干细胞迅速进入人类心肌梗死临床试验阶段，速度之快，规模之大，前所未有。但是，新近荟萃分析表明心肌梗死和心衰患者的心功能有所改善，但硬性终点事件并未改善，远期疗效也有争议；而且骨髓细胞治疗改善心功能的机制主要是旁分泌机制，而不是原先认为的干细胞分化为心肌细胞（心肌再生）。作为另一种有潜力的细胞类型，hESCs的确可以形成真正的心肌细胞，但由于伦理和安全性问题，应用于临床试验的步履异常缓慢，这和骨髓细胞形成了鲜明的对比[1]。走过梦幻的细胞移植治疗后应当何去何从？也许我们在再一次的回首中能找到些许答案。本章内容将聚焦于心肌梗死和心力衰竭的细胞治疗，如要了解心律失常和血管损伤的细胞治疗内容，可参阅相关资料[2，3]。一、细胞移植的理论基础
人们一直以为，心肌面对损伤的反应是肥厚而不是增生。成人心脏无法再生的原因是成熟心肌细胞无法分裂（终末分化细胞）以及内源性前体细胞缺乏。但研究发现：
（1）成体心肌细胞存在分裂现象，老年大鼠心脏的相当一部分心肌细胞随着细胞分裂，端粒酶活性下降，端粒长度缩短，提示业已存在的心肌细胞在维护正常心脏功能方面扮演关键角色。
（2）心肌细胞的确存在分裂，虽然分裂速率极低；人类心肌梗死后1周，缺血交界区分裂的心肌细胞数量显著增加（占4%心肌细胞，增加3～4倍）。
（3）成人和成年大鼠心脏中存在表达干细胞标志性蛋白的细胞群，称为心脏自身干细胞（CSCs）。成年心脏中的CSC休眠于生态位（niches）中，缺血损伤后，通过旁分泌信号激活CSC并开始分裂。但CSC分裂形成的新生心肌细胞太少，无法代偿弥补大量的坏死细胞[4]。
心肌存在自我更新的发现具有启迪意义，提示我们可以通过刺激干细胞自我修复过程或补充干细胞等治疗策略促进心肌修复，这就是心肌细胞缺失性疾病进行细胞治疗的理论依据。
广义来说，有三种方法可用来检测心肌细胞是否增殖：
（1）直接计数正在DNA合成或表达细胞增殖标志物（如Ki67）的细胞数量。
（2）脉冲追踪实验。
（3）利用19世纪50年代核爆炸试验后大气14C增加水平来定量细胞更新[5]。研究表明，小鼠和人类心肌细胞存在更新，更新速率呈年龄依赖性，心梗后更新加速。但更新程度究竟如何？不同试验方法得出的结论不同：Ki67试验表明每4.5年心肌细胞几乎完全更新一次；但14C试验结果显示25岁时每年有1%心肌细胞更新，而到75岁这一数字降到0.45%，一生中大约只有50%心肌细胞更新[6，7]。
心肌缺血或心力衰竭时，心肌细胞大量丢失，如一次大面积心肌梗死可毁坏25%的左室心肌，约合十亿个心肌细胞[8]。显然心肌自身更新不足以修复损伤心肌。受损的心肌细胞主要由巨噬细胞清除，瘢痕组织替代，周围由成肌纤维细胞包裹。由于修复组织缺乏收缩能力，心脏势必逐步走上心力衰竭的不归路。理想的细胞治疗，大量新生心肌不仅能替代坏死组织甚至纤维组织，而且收缩同步、电偶联良好，同时伴有血管新生提供心肌营养。
二、临床研究最新进展
（一）骨髓细胞治疗心肌梗死的短期疗效（临床荟萃分析）
早期动物实验和早期非随机性临床研究无一例外的显示干细胞获益的通用性[9]：细胞治疗可以改善心肌梗死动物或人类的射血分数、心室容积、梗死面积和心肌灌注；更令人兴奋的是，细胞治疗的获益不分细胞类型、自体或异体、移植剂量，移植后时机（心肌梗死后时间）、心衰原因（缺血性或非缺血性）、移植途径（肌内注射、冠脉移植甚至冠状窦内或体静脉），颇有南非世界杯足球“普天同庆”的意味。用“神奇”来形容当时情景也不为过。热情过后，人们开始反思一些颇费思量的现象，例如细胞剂量相差达6700倍之多，疗效却相近？心功能改善在移植后72小时就显现，在细胞再生前就开始出现？
为探究真相，随后组织了一批的随机对照临床试验，出现了不同的声音，其中包括Janssens等的研究、ASTAMI研究、STEMMI研究等显示阴性结果的临床试验。至此，“神奇”变为“混乱”。为廓清此混乱局面，2007年以来，有数个骨髓/外周血干细胞移植治疗心肌梗死的临床试验荟萃分析公布[10～14]，如Abdel-Latif等[11]纳入12个RCT研究和6个队列研究进行荟萃分析（图6-1），骨髓单个核细胞（BMCs）移植数量为2×106～60×109，随访3～6个月，相比对照组，LVEF提高3.66%（P＜0.001），
梗死面积减少5.49%（P＝0.003），左室收缩末期容积减少4.80ml（P＝0.006）。复旦大学附属中山医院的荟萃分析[15]纳入5个RCT研究，共525例急性心肌梗死患者，随访3～6个月，与基线相比，冠脉内BMCs移植组LVEF提高7.05%，对照组仅为2.46%。与对照组相比，移植组LVEF增加4.77%（95%CI 1.42%～8.12%；P＝0.005），主要心血管事件（MACE）两组差别无统计学意义。Singh等[14]的研究结果也相类似。
因此，目前的共识是，骨髓细胞移植对急性心肌梗死患者短期心功能有轻度改善作用。那么，对长期心功能又有何影响呢？
图6-1 Abdel-Latif等的荟萃分析结果[11]
（二）骨髓细胞治疗心肌梗死的长期疗效
细胞移植的长期疗效是一个有争议的话题。BOOST随机对照研究18个月长期随访研究中，对照组和移植组LVEF分别升高3.4%和6.4%，差异不显著（P＝0.27），提示急性心肌梗死后单次移植骨髓细胞并不能持久改善心功能。
但近年来更多的研究对此提出挑战。
（1）TOPCARE-AMI研究5年随访发现，骨髓细胞移植组患者磁共振LVEF改善依然保持甚至有进一步加强，血浆氨基末端脑钠素前体（NT-proBNP）水平持续降低，提示细胞移植对左室重构有长期疗效。
（2）BALANCE研究[16]于2009年6月正式公布，随访长达5年，发现急性心肌梗死患者经细胞治疗可以长期有效地改善急性心肌梗死患者的LVEF、生活质量和降低死亡率：62例急性心肌梗死患者接受冠脉内自体BMC移植。BMC治疗3个月后梗死区域收缩性明显改善，左室缩短速率增加31%，LVEF和心室功能曲线有明显的改善，梗死面积明显减少8%。治疗后12、60个月，收缩性、血流动力学状态和LV形状均稳定[移植组0、3、12、60个月LVEF分别为（51.6±11）%、（59.5±12）%、（58.3±11）%、（56.9±9）%，对照组0、3、12、60个月LVEF分别为（50.8±10）%、（52.4±9）%、（49.5±9.3）%、（46.9±8.3）%]；晚电位、心率变异性和异位搏动等异常活动植入BMC后明显减少；细胞治疗患者活动量明显增大，死亡率也有所下降。
（3）2010年1月公布的一项来自德国的双盲对照多中心研究临床试验[17]也显示，在2年随访时间里，冠脉内移植自体骨髓细胞显著减少主要不良心血管事件，心功能也持续改善（www.；NCT00279175）。
因此，虽然细胞移植长期疗效尚未定论，但显然，目前的临床证据倾向于有效，BOOST研究的阴性结果可能与样本量较小（每组30例）有关。另外，如果细胞移植疗效呈一过性或暂时性，复旦大学附属中山医院[18]证实二次移植心脏功能的改善明显优于单次移植，“重复细胞移植”为MI患者提供了便捷的细胞疗效优化策略。
（三）骨髓细胞治疗心肌梗死与常规治疗的疗效比较及其硬终点疗效
另一个非常有趣的问题是，现阶段干细胞治疗效果能否满足人们的期待？和药物溶栓、经皮冠脉介入、传统药物治疗相比，细胞移植治疗急性心肌梗死的疗效究竟如何呢？让我们先回顾一下急性心肌梗死传统治疗的疗效[19]。
（1）静脉溶栓：ISAM试验表明，急性心肌梗死6小时内经静脉链激酶治疗后3～4周，链激酶组LVEF为（56.8±0.7）%（428例），对照组为（53.9±0.7）%（420例）。但对冠脉或静脉应用链激酶的10个随机对照临床试验（14 355例）进行荟萃分析表明，溶栓后头6周的死亡率降低；但对左室功能的影响是非结论性的，只有成功再灌注亚组患者才有LVEF的显著改善。
（2）急症经皮血管成形术：Zijlstra等完成的里程碑式研究表明，即刻血管成形术（无支架）患者（70例）的靶血管再通率高于链激酶溶栓患者（72例），出院前LVEF高于溶栓患者[（51±11）% vs（45±12）%，P＜0.004]；另一多中心研究比较重组组织型纤溶酶原激活剂（rTPA）溶栓（200例）和即刻血管成形术（195例）治疗发病12小时内心肌梗死患者的疗效，发现血管成形术组的6个月死亡和再次心梗发生率更低[（16.8% vs. 8.5%），P＜0.02]，但6周LVEF相类似[（53±13）% vs （53±13）%]。Ribichini等比较rTPA和血管成形术（liberal stenting）（55例，其中58%支架置入）治疗急性下壁心肌梗死患者的疗效，1年死亡、再梗、靶血管血运重建的联合终点事件发生率介入组显著低于溶栓组（11.0% vs 52.7%，P＜0.0001），LVEF结果与此一致[（55.2±9.5）% vs（48.2±9.9）%，P＜0.0001]。
（3）药物：β受体阻滞剂治疗急性心肌梗死：CAPRICORN随机双盲对照研究纳入1959例急性心梗后LVEF≤40%的患者，随访平均1.3年；发现卡维地洛组的总死亡率较安慰剂组为低（12% vs 15%，P＝0.03）；心脏超声心动图亚组分析（127例）发现，6个月时卡维地洛组的左室收缩末期容积较安慰剂组为低[（4.8±4.9）ml vs （＋4.5±2.8）ml；P＝0.023]，LVEF较安慰剂组为高[（＋5.0±1.1）% vs （＋1.0±1.2）%，P＝0.015]。SAVE研究、HEART研究和VALIANT研究了血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂治疗心肌梗死的LVEF改善也在1%～4%之间。
心脏病细胞治疗临床试验可以有很多观察指标和评价终点（表6-1），但其中最具说服力的硬终点事件是死亡和心衰，一般需要有1400个病例数的临床试验才有充足的检验效能[9]。采取替代终点比较方便和实用，但有可能误导临床实践。为什么目前细胞治疗心肌梗死和心衰的临床证据力度不足，屡屡遭人质疑？症结就在于此。有人认为LVEF提高5%以上就可能改善症状，提高生存率。但仅仅是间接推理。即使有更多的临床试验和荟萃分析证明细胞治疗能改善心脏收缩功能，即使LVEF的提高超过业已成熟的治疗策略，倘若没有硬终点的直接证据，细胞治疗依然没法真正走进临床一线。因此，以后的临床研究设计更应着眼于对临床终点事件的影响，而不仅仅是心功能的改善。
表6-1 干细胞治疗心肌梗死临床试验的观察终点
上面探讨的主要是急性心肌梗死患者的细胞治疗。接下去简述细胞移植的另一组重要候选人群：21世纪心血管领域有待攻克的3大堡垒之一——终末期心衰患者。等待心脏移植、需要心室辅助装置支持（移植前过渡措施或最终治疗）或需要外科心肌成形术的终末期心力衰竭患者，预后均极差，人们希望细胞治疗可在一定程度上改善症状或预后。但终末期心衰阶段，心脏的基本病理改变为广泛纤维化，“大漠无边”的恶劣环境可能严重制约细胞移植的疗效，对于耐缺氧特性较差的骨髓细胞影响更大。
对慢性缺血性心脏病引起的心力衰竭患者，有一些小规模的Ⅰ期临床试验公布，结果表明自体骨髓细胞移植疗效不一，但趋向有效（表6-2）。复旦大学附属中山医院在TCT-STAMI-1临床试验[20]的基础上，开展了最佳移植时机的临床研究，发现MI后24小时至2周骨髓干细胞治疗均可提高梗死心脏功能，而MI后3个月后进行自体骨髓干细胞移植，并不能改善患者梗死面积和左室收缩功能，只可能对心脏舒张功能有益[18]。TOPCARE-CHD研究为较大规模的随机交叉临床试验，共有75例患者随机分配到骨髓细胞治疗组、外周血细胞治疗组和对照组，结果表明只有骨髓细胞组能改善LVEF和局部室壁收缩性。最近的一项随机试验[21]表明，自体骨髓MSCs移植治疗慢性心力衰竭和心绞痛，虽然心脏功能没有明显提升，但胸痛有显著减少。目前正在进行的REGENERATE-IHD研究是最大规模的骨髓细胞移植治疗慢性缺血性心衰的随机对照临床试验，计划纳入300例患者，将为该问题提供更权威的结论。
表6-2 慢性缺血性心力衰竭的Ⅰ期非随机临床试验
总之，干细胞移植治疗心肌梗死的安全性和概念验证研究已有初步的结论，下一步的任务是组织大型的随机对照研究，关注细胞治疗修复心肌在改善心脏功能的同时，是否减少致死率和致残率？这是这项新兴治疗能否最终走向临床常规实践的金指标，也就是前面论述的硬指标。在分析临床试验结果时，应注意到积极的再灌注策略本身已经促进了急性心肌梗死患者心脏收缩功能的恢复，极大地改善了患者的预后。但仍有大约20%的ST段抬高型心肌梗死患者，血运再灌注无法改善心脏功能。对这部分患者而言，致死率和致残率仍然居高不下，过去15年来经皮冠脉介入的进展也没有改变此现状[23]。这部分人群应该成为细胞治疗的主要对象[24]。而另一种适应证主要对象应该是终末期心力衰竭患者。
三、基础研究最新进展
理想的供体细胞应该能在体内或体外分化为成熟的心肌细胞，并在心肌坏死区长期存活且与宿主心肌细胞建立起电机械偶联，形成同步收缩，恢复受损的心功能。诚如前述，目前的临床试验绝大部分采用的是自体骨髓细胞，存在一系列不尽如人意之处。
（1）心功能改善轻微，且疗效不稳定而多变。
（2）骨髓细胞移植改善心功能的机制存在争议。
（3）移植剂量、时间和途径等尚未优化。围绕这些问题，近年来国内外干细胞基础研究取得了不少进展和共识。
（一）骨髓细胞功能的改进
骨髓细胞临床试验所凸显的一个问题是疗效不够稳定，很多细胞的获益仅仅局限于短期获益，或仅仅局限于急性MI。其原因可能与经离心沉淀分离的骨髓细胞中细胞类型鱼目混珠，其中能真正发挥治疗作用的干细胞数量较少且多变，与年龄、疾病状态、用药等因素有关。糖尿病、缺血性心肌病、心衰时骨髓干细胞数量和功能均下降，影响移植疗效。为获得优质高效的骨髓细胞，目前采取的方法有同种异基因骨髓来源、细胞因子或药物预处理骨髓细胞、基因修饰骨髓细胞等。
1.同种异基因骨髓细胞 由于慢性心衰患者本身的骨髓细胞功能受损，从正常成人分离获得骨髓细胞可成功避免此缺陷。间充质干细胞（mesenchymal stromal cells，MSC）是该方法的最佳候选，因为MSC具有免疫豁免（immunoprivileged）的特性，通过分泌免疫调节因子和抑制T细胞增殖逃避排斥反应。MSC只占骨髓有核细胞的0.001%～0.01%，脂肪组织中含量较高，每100ml脂肪组织含1×106MSC。但能体外扩增和储存，对急性MI和心衰患者能实现普通药物一样的“off-shelf”治疗，而不再需要等待。Osiris公司的细胞商品Prochymal正在进行相关临床试验（www.；NCT00877903）。
2.细胞因子或药物预处理 研究发现，间质衍生因子-1α（SDF-1α）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）预处理，能促进骨髓细胞的存活和分化。Robey等发现甲酰化促红细胞生成素（CEPO）能提高人ESCs衍生心肌样细胞的存活率，并独立于热休克效应[25]。国内有学者发现他汀类药物可改善梗死微环境从而提高移植效率，但Leone AM研究[5]发现心肌梗死患者PCI后强化降脂治疗虽可进一步动员骨髓细胞并增加循环血EPCs数量，但并不能改善左室功能。虽然越来越多的证据显示，骨髓干细胞并不具有横向分化为心肌的可能，但仍有人心存希望。最大胆的设想莫过于“预处理诱导骨髓间充质干细胞心肌定向分化”。通过对内胚层secretome进行基因组学和蛋白组学对比分析，确定信号分子。信号因子预处理干细胞，模拟心脏胚胎发育早期阶段的局部微环境理化特性，使干细胞分化定向为心脏方向[26]。现已应用于缺血性心肌病的Ⅱ～Ⅲ期临床试验，该试验共纳入240例有心肌梗死史、NYHA Ⅱ～Ⅲ级、LVEF 15%～40%的心衰患者，自体骨髓MSC移植前用“诱导心脏生成的鸡尾酒”预处理（www.；NCT00810238）。
3.骨髓细胞基因修饰 基因修饰能改善细胞的功能状态，使表达新生血管生成所需要的生长因子或保护性物质，从而有利于坏死区及周围血管的生成，这对于移植细胞存活和心脏功能改善都有重要意义。基因修饰也可增强信号通路转导，改善干细胞的存活、归巢和植入[27]。比如内皮一氧化氮合酶（eNOS）基因修饰后可增强骨髓细胞的迁移能力。eNOS基因修饰可增强EPC的血管新生作用，探讨eNOS-EPC治疗急性心肌梗死的6个月疗效的ENACT-AMI临床试验正在加拿大渥太华进行（www.；NCT00936819）。当然，基因治疗联合干细胞移植也存在如选择载体的有效的转染率、治疗的安全性和准确性、移植后远期效率等问题。
4.其他成体干细胞 临床前实验表明，源自脐带血、羊膜、脂肪组织和外周血的干细胞直接注入到心脏或归巢到心脏后，作用机制和疗效基本类似骨髓源性干细胞。从本质上，并未超越骨髓干细胞的特性。
（二）新型干细胞的研发
骨髓细胞是目前临床试验的主要细胞，原本认为，骨髓干细胞转分化为心肌细胞是细胞治疗的基石所在。最早，在受体动物中枢神经系统中发现表达神经元典型标志物的供体来源骨髓细胞[28]，由此提出转分化概念，即干细胞“转分化”非本系的细胞类型。当表达绿色荧光蛋白的骨髓细胞注入小鼠心脏，能同时表达心肌标志物，改善MI后的心脏功能[29]，提示存在“心肌转分化”的可能性。但随后试验采用β-gal标记细胞却未能证实，因此很可能是干细胞和残存心肌细胞的融合，而不是真正的转分化。尽管如此，由于在最初个案报道中，自体骨髓细胞移植治疗心肌梗死均取得较好疗效，一时间小型临床试验大有燎原之势，大型随机双盲对照临床试验也随即跟进。目前，虽然尚有少数研究提示骨髓干细胞仍有心脏分化的可能[30]，但普遍性的共识是骨髓干细胞移植的心功能获益可能来自于移植细胞通过旁分泌机制挽救缺血心肌（如分泌生长因子诱导血管新生等），而不是原本设想的心肌细胞数量的增加（图6-2）。这在啮齿动物实验中也基本证实：骨髓细胞能诱导梗死周围区域血管新生，挽救缺血心肌，但并未发现稳定的移植细胞植入[31]。
图6-2 细胞移植改善心脏功能的可能作用机制示意图
诚如前述，目前认为骨髓细胞修复梗死心肌的作用机制主要是促血管生成、抗心肌凋亡等旁分泌作用。这种解释难免有些令人气馁，相对“再生医学”的原义似有“跑题”之虞。没有细胞分化，谈何细胞移植？谈何心肌再生？因此，寻找具有心肌分化能力的细胞类型一直是干细胞基础研究最活跃的领域之一[32]。进入研究视线的可能具有真正的心肌分化潜能的细胞类型有胚胎干细胞（ESCs）、诱导式多能性干细胞（iPS）、残存心脏自身干细胞（CSC）、心外膜衍生干细胞、精原干细胞等[33]。
只要将少量hESC衍生心肌细胞（hESC-CMs）植入猪和豚鼠心脏，就能发挥生物起搏器的功能；那么，如果将大量hESC-CMs注入心脏，其再生潜能又该如何？hESC-CMs注入到免疫缺陷大鼠或小鼠的正常心肌组织可以存活，但成熟至少需要12周时间；虽然注射液中包含多种不同的细胞成分，但只有心肌细胞能够存活。虽然植入细胞相互之间形成合胞体，但植入细胞和受者啮齿动物心肌细胞之间由一层纤维组织相分割，如骨骼肌成肌细胞移植时不能和受者心肌相偶联。失偶联是骨骼肌成肌细胞移植致心律失常的潜在原因。由于hESC-CMs等细胞还具有内在起搏活性，无疑比SkMs更具致心律失常的可能性。因此，hCPCs临床试验可能需要ICD植入保驾。
迄今为止，ESCs细胞移植治疗心肌梗死还未用于临床研究。除顾虑致心律失常性外，其他原因包括：
（1）ESCs定向分化心肌细胞的效率低，难以纯化得到足够数量的心肌细胞。
（2）ESCs移植后产生免疫排斥反应。
（3）ESCs来源于囊胚期胚胎，对其进行研究和应用涉及伦理学问题。
（4）ESCs存在致瘤性，其安全性需进一步研究。
2.心脏自身干细胞（resident cardiac stem cells，CSC） 2003年台湾和美国的研究人员在实验鼠和人类心肌组织中先后发现了心脏自身干细胞，颠覆了传统的“心肌不可再生”理论。心脏自身干细胞筛选标记常采用c-Kit＋、Sca-1＋、Islet-1＋等，可从活检心肌组织中分离并体外扩增，具有较大自身移植潜力[34]。Sca-1阳性残存心脏干细胞优先分化为心肌细胞，其次为平滑肌细胞和内皮细胞，但不易获得[35]。有人认为心脏中发现的少量c-Kit细胞，可能来自于骨髓[36]。另外，成体心脏c-Kit细胞同时表达肥大细胞标志物，缺乏表达NKX2.5和ISL1。因此，这些细胞并非CPCs，而是骨髓细胞游出迁徙而已。小鼠细胞世袭追踪有助于确定成体心脏是否真正含有干细胞。不管源自何处，只要能真正分化为心肌细胞，这些细胞就可能用于细胞治疗。
CSC移植治疗急性MI的动物实验表明，CSC可减轻左室重构，减少梗死面积并提高收缩能力。目前关于心脏自身干细胞的1期临床试验在美国Louisville大学Jewish医院和日本京都医科大学分别同步实施（www.；CT00474461，NCT00981006）。
3.诱导式多能性干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS） 2007年Takahashi等[37]和Yu等[38]分别在Cell及Science杂志同时报道，皮肤成纤维细胞经过病毒载体直接重组4个干细胞相关基因（Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc）后可以转化成为具有ESCs特性的多能干细胞，称为诱导式多能性干细胞。这种后天性的人为重组导致成体细胞表型的变化，表达早期胚胎标志物（SSEA-1），导致免疫缺陷受者畸胎瘤形成，如整合入嵌合体动物的早期胚胎，能形成所有三个胚层细胞。最近只用3个重组因子（OCT3/4，Sox2，Klf4）便成功生成鼠iPS，以避免c-Myc原癌基因相关的致肿瘤可能性[39]。iPS的诱导成功是干细胞研究里程碑式的进展。iPS比MSCs更原始，具有ESCs特性，但从根本上避免了ESCs的道德争议，也使得干细胞来源更不受限，为再生医学提供了无限的想象空间。Zhang J等新近证实iPS细胞能分化为心房、心室和房室结样细胞[40]。鼠iPS整合入前植入桑椹胚后，能产生解剖和功能均正常的嵌合体小鼠心脏[41]。成年鼠梗死心脏内注射iPS后4周，心肌细胞和内皮细胞新生，改善了收缩功能[41]。
但iPS的移植疗效和安全性尚需进一步的实验证实。由于致瘤性和致畸性潜质，短期内不太可能应用于人类。2010年2月，美国斯坦福大学医学院宣布绕过iPS这一步骤，直接将实验鼠皮肤细胞转化为神经细胞，这项研究由于避免了iPS致畸性和致瘤性的内在缺陷，而且转换效率高，可能成为再生医学的又一里程碑式成果。
4.极小胚胎样干细胞 美国路易斯维尔大学Kucia研究小组从小鼠骨髓和人脐带血中分离出一种具有类似胚胎干细胞生物特性的多能干细胞，由于体积极小（3～6μm），命名为极小胚胎样干细胞（very small embryonic-like stem cells，VSELs）。VSELs可能来自外胚层干细胞，器官发生时残留在各组织所致。在体外可以被诱导分化为内胚层细胞、中胚层细胞、外胚层细胞。若作为组织工程和临床治疗的种子细胞，可避免伦理争议，具有良好的应用前景。在动物实验中，小鼠MI和急性MI患者均有骨髓的VSELs快速动员入外周血，VSELs富含干细胞标志物和早期心脏及内皮转录因子，提示VSELs对梗死心肌具有修复作用[42]。再灌注MI小鼠模型直接心肌内注射微量VSELs（10 000个细胞）具有某种程度的定向分化潜能，对损伤心肌具有修复作用[43]，移植前VSELs体外预分化可显著增强疗效。但目前尚无自体VSELs临床试验的报道。
5.精原干细胞 另一种有ESCs等效的分化全能性细胞是精原干细胞，位于雄性哺乳动物的曲细精管生精上皮基膜内侧，体外适当培养条件下（而不需要转导基因），可自然转化为ESCs样细胞，可分化为包括心肌细胞和血管细胞在内的多种细胞[44]，因此理论上可用于多种疾病的细胞再生治疗。
6.心外膜衍生细胞 在心肌、心肌血管和传导系统发育过程中，心外膜来源的细胞发挥重要作用。成人心房组织分离心外膜衍生细胞后，移植到小鼠心肌梗死区，能上调心脏特异性蛋白，保护心脏功能，减轻心脏重构，说明心外膜衍生细胞可能有潜在的临床应用价值[45]。
必须指出，细胞类型的筛选仅仅是分化潜能的筛选，如何建立定向分化环境可能是更艰巨的历史使命，这在很大程度上有赖于胚胎发育学的研究进展。如果CPC的细胞生物学研究有所突破，能识别并激活内源性CPC的生长调节旁路，无疑可促进其更新修复功能。另外，虽然实验研究表明不少细胞类型能促进心肌再生，增强收缩功能，但临床应用后能否产生类似疗效尚不清楚。
（三）微环境和“土壤”研究进展
移植干细胞的转归是影响移植疗效的决定性因素，细胞有利的分化方向是开展干细胞移植的理论基础。细胞赖以生存微环境中的生物化学因素和物理因素至关重要。在MI后或心衰时局部微环境非常恶劣：炎症，纤维化，缺血，缺氧等。另外，生化微环境是一个复杂的生物信息网络系统，有时同一细胞因子会存在两种完全不同的生物学效应，致使一些研究结论相互矛盾。最近有不少研究跳开细胞类型（种子）研究的固有思路，对微环境（土壤）进行了研究。
1.引导心脏生成（guided cardiopoiesis） 通过对内胚层分泌功能进行基因组学和蛋白组学对比分析，确定信号分子。信号因子预处理干细胞，模拟心脏胚胎发育早期阶段的局部微环境理化特性，使干细胞在应用前预分化定向为心脏方向[9，26]。需同时分析生长因子和营养因子的协同作用，模拟内胚层分泌蛋白组学，引导多能干细胞向心肌特异的方向分化塑形，抑制不可控的生长特性。“引导发育”的理念已被应用于临床领域。例如，预处理诱导骨髓间充质干细胞试图心肌定向分化，现已应用于缺血性心肌病的Ⅱ～Ⅲ期临床试验。用促心脏生成和促存活因子处理hESC-CMs，移植后存活率得到极大提高[26]。总之，引导心脏生成的微环境相关研究势必极大促进再生医学的发展，甚至有可能发挥关键性作用。
2.基质弹性作用 复旦大学附属中山医院[46]通过前期研究首次揭示了小鼠梗死心肌（包括细胞外基质）在病患发展过程中存在由“软到硬”（基质弹性由低到高，弹性模量值由小到大）的时间依赖性弹性/硬度变化规律，在此基础上提出了影响干细胞移植疗效的“基质弹性学说”，即在心肌梗死后的一段时间内，梗死心肌的弹性较其他时期的心肌弹性可能更有利于移植细胞向有利于梗死心肌修复的细胞类型（如内皮系细胞、平滑肌细胞或心肌样细胞）分化，从而促进梗死区域新生血管的形成和心肌细胞的再生，进而促进病损心肌的修复并减少心脏功能的丢失。在对本假说的科学验证中发现，基质弹性在促进BMMNCs向内皮祖细胞（EPC）分化中发挥着重要作用，42kPa（模拟心肌梗死后7～14天心肌弹性）的促细胞内皮系分化效应优于其他弹性模量，基质弹性与VEGF浓度在促进BMMNCs向EPC分化过程中可能发挥着协同作用。对于这一科学问题的阐明，有利于选择病损心肌理想的物理特性开展细胞治疗，以达到移植疗效的最优化。
3.心室形态学说 扩张型心肌病进展到高死亡率的晚期时，原本椭圆形的心脏变为球形。缺血性心脏病患者的存活率和收缩期容积指数（反映扩张心脏的形态）相关。对心肌修复而言，细胞移植的土壤不仅指可存活的组织微环境，还应该包括合适的心脏几何形态：圆锥形或椭圆形形态最有利于细胞移植后功能恢复[1，47]。我们都知道，心肌存活的心脏扩大患者如果仅仅施行瓣膜修补手术，而不重建心室形态，他们的长期死亡率仍然相当高。与此类似，对低灌注存活心肌的心脏扩大患者而言，细胞移植再成功，也无法恢复心脏形态，无法取得预期疗效也就不足为奇了。在既往临床或基础研究中，如考虑最佳临床策略或解释临床前动物研究结论时，心室形态的作用显然没有被足够重视。干细胞并非万能，单靠干细胞本身无法承担重建心脏形态和恢复心脏功能的重任。因此，改善心脏形态的治疗可能和细胞治疗有协同作用，Dai等[48]证实将胶原注入大鼠梗死区可以增厚瘢痕组织，改善形态和射血分数，但未验证对细胞移植疗效的影响。
（四）移植方法学进展
目前看来，成体干细胞虽然并不形成心肌细胞，但相对安全、自体来源，因此临床应用更加可行。在没有得到理想的细胞类型之前，优化骨髓细胞疗效仍然是有意义的研究。因为方法学研究对于任何细胞类型都具有借鉴意义。
1.促进细胞靶向归巢 干细胞归巢问题是干细胞治疗的基础，是干细胞发挥生物学功能的前提，移植细胞如何有效特异的归巢至病损心肌部位是一项重要的科学问题。直接心肌注射时，植入细胞24小时死亡率大于50%，14天后梗死区内移植细胞量仅占移植总量的3%。经导管冠脉内移植骨髓细胞的心脏归巢仅占1%～6%，大部分细胞分布于肝脾等组织。经静脉移植时只有极少量归巢到受损心肌，甚至有研究发现其心脏归巢率几乎接近于0。现阶段移植细胞的归巢率离精确“定位”和临床期望还有很大差距。
由于归巢涉及的“细胞-细胞外基质-细胞因子”网络极其复杂，其中的调控机制仍不清楚，因此近年来以归巢细胞因子为靶点（包括动员相关因子如G-CSF、SCF和SDF-1，归巢相关因子SDF-1/CXCR4轴，黏附因子整合素等）的相关研究始终未有突破性进展。寻找新的有效的促进归巢方法是当前干细胞移植的难点和热点之一。复旦大学附属中山医院[49，50]自主研发了“空间定位聚集磁性颗粒装置”，运用电动力学、磁力学原理详细分析了磁标记骨髓间充质干细胞在空间聚焦磁场中的动力学过程，对深度聚集规律进行了理论解释，为较深部位细胞靶向归巢等研究提供了强大的理论支撑和实验基础。该研究结果发表于2010年生物材料杂志Biomaterials。如能将该磁场导向新策略引入冠心病细胞治疗，调控促进移植细胞的心脏归巢，势必极大地提高冠心病的细胞移植疗效。深度聚集理论的提出和装置的研发突破了传统磁导向治疗的概念和局限性，不仅将磁导向细胞靶向治疗的范畴拓展应用到心脏等机体深在部位，也将极大的促进磁靶向药物治疗（MDT）的发展。
2.组织工程化心肌移植 心肌组织工程是在体外将细胞接种到生物材料上形成一定形状的类组织结构，然后通过手术的方式移植用于心肌修复。Leor等将新生大鼠心肌细胞接种至藻酸盐支架上，发现细胞在支架内均匀分布，接种24小时后，大多数细胞排列形成有活力的多细胞三维聚集物，可以发生有节律地收缩。将藻酸盐支架移植到大鼠梗死心肌的表面，2个月后，支架与相邻的梗死组织连接，并部分进入梗死组织。Zimmermann等将新生大鼠心肌细胞和液体l型胶原蛋白、Matrigel及细胞培养液混合，经处理后使其形成具有一定形状的工程化心肌组织（engineered heart tissue，EHT）。将EHT缝合固定到正常心脏心外膜表面后，EHT能够存活、成熟和搏动；将EHT固定到梗死部位心外膜面，可以改善心脏收缩和舒张功能。Miyahara等将通过细胞片技术制备的单层MSCs移植到梗死心肌的表面，4周后，移植物新生组织内含有新生血管、未分化的MSCs和少量的心肌细胞。新生组织通过逆转室壁变薄、降低左心室室壁应力和左心室重构改善心脏功能。Lesman A等[51]发现人组织工程化的血管化心肌组织植入大鼠心脏后能形成稳定的移植物，其中的人类血管结构能有效整合并发挥组织灌注功能。他们将人胚胎干细胞衍生心肌细胞（ESCs-CMs）、人脐静脉内皮细胞和胚胎性纤维母细胞组成三合培养物种植到生物可降解多孔支撑物上，将该组织结构物移植到大鼠心脏，形成心脏组织移植物，人特异性CD31和α-actin免疫检查显示植入的三合组织构造物内形成供者（人）和受者（大鼠）衍生的血管结构，并和受者冠脉血管结构发生功能整合。
原位心肌组织工程利用可注射的生物材料承载细胞，直接注射到梗死部位。Christman等首次将细胞与纤维蛋白原和凝血酶同时进行注射移植有利于细胞的存活。纤维蛋白凝胶可以诱导梗死部位血管新生，减少梗死面积扩大。也有心肌内注射藻酸盐、自聚肽纳米纤维等报道。但疗效有待进一步证实，但毕竟所有新方法的尝试都是值得鼓励的。
3.其他环节的优化治疗 研究应该进一步聚焦于作用机制的进一步研究，并发现最佳的细胞类型、数量和移植时间，达到疗效的最优化。目前尚无直接比较不同细胞类型、不同细胞剂量疗效的大动物试验，即使在啮齿类动物，此类实验也极少[52]。如果旁分泌机制主要是生长因子起作用，那么直接注射生长因子注射到心脏便可挽救受损心肌，最好是移植基因修饰干细胞，以保证足够长的作用时间。
四、动物实验的反思：注意动物和人类的区别
啮齿动物缺血性心脏病模型常采用结扎前降支的方法，可造成大面积左室心肌损伤（可达65%），由于心功能参数改变较大，在样本量较小的情况下也容易达到统计学差异。大鼠小面积的心肌梗死（左室的30%～40%）并不能引起血流动力学参数的稳定变化。但对人类而言，同样面积的梗死通常是致命的，因此一般不存在大块“纤维帽”（cap of fibrous tissue）替代超大面积的心肌坏死的情况。
人类和啮齿动物心肌细胞的固有搏动频率不同，人类心肌细胞搏动频率为60～100次/分，而啮齿动物心肌细胞的跳动频率达300～600次/分。细胞失偶联导致心功能不能长期改善；假如偶联良好，对人类心肌细胞而言，被诱发出如此快的搏动频率无疑是一种灾难，可诱发室颤或失去收缩功能。大动物心率和人类接近，同种移植无疑能较好地解决该问题。
心梗啮齿动物细胞移植后疗效常为短时性，难以持续。多数细胞治疗仅仅减轻早期损害，仅仅改善心脏功能。当大面积左室室壁受损时，额外的机械负荷势必损伤其他存活细胞。如何尽量避免此问题？啮齿动物麻醉后切断迷走神经，避免心率变化，此时，心功能参数（如排出量、LVEDV、心脏做功）就能敏感地随少量的心肌梗死而变化，此时就能在啮齿动物中敏感的检测并比较不同细胞类型、不同移植方法的细胞疗效[53，54]。事实上，迄今为止，即使是在啮齿动物中也一直缺乏这种直接的比较研究。
大动物和人类有更多的类比性。不管是心脏的解剖和生理，抑或冠状动脉的分布和侧支发生，抑或心肌梗死后形态学和功能学的改变，猪都能基本模拟人类的临床表型，可作为心肌梗死和心力衰竭的最佳动物模型。基线心功能稳定的高质量心肌梗死动物模型对保证实验科学性至关重要，不稳定的模型足以对研究结果构成混杂和干扰。传统猪急性心肌梗死模型常以对角支为坐标结扎前降支，模型稳定性不尽如人意。复旦大学附属中山医院[55]在总结长期动物实验经验的基础上发现，猪对角支变异较大，以前降支全长为坐标选择合适的结扎百分位点能建立更稳定的猪心肌梗死模型；这对保证干细胞大动物实验研究的科学性发挥有益作用。
五、展望
十年前，关于患者选择、细胞种类、细胞最佳体外操作方法、细胞数量、移植时机、移植途径、作用机制等基本问题，我们一无所知；十年后的今天，当面对这些老问题的时候，我们依然无法给出准确的回答。但是，我们对细胞治疗的理解和把握已非十年前的懵懂少年。不管是科研方法，还是观念态度，干细胞研究在种种质疑和思辨中不断成长成熟（表6-3）。
表6-3 质疑和对策
诱导式多能性干细胞（iPS）、残存心脏自身干细胞（CSC）等新型细胞种类的尝试
为什么细胞植入、存活、分化如此低下，临床试验却仍然有效？
引发机制的深入探讨：旁分泌机制可能是目前临床试验疗效的主要机制
在具体机制尚未阐明之前开展临床试验和应用是否过早？
机制争议或讨论不影响疗效的评价，心内科已有不少“临床应用先于机制阐述”的先例，如阿司匹林、他汀类、ACE抑制剂和醛固酮抑制剂细胞移植临床应用泛滥，低水平重复
2009年中国卫生部将细胞移植治疗技术列为第三类医疗技术，加以监管
患者选择、细胞种类、细胞数量、移植时机、移植途径等基本步骤的优化
急需“头对头”的比较研究
我们认为，心肌修复不只是细胞再生，而是整个配套设施（如支持细胞、血管、神经、细胞因子等）的系统工程，我们现在摸到的可能只是大象的鼻尖而已。但我们也相信，梦想和困惑永远是前进的动力。最后，借用《西游记》主题曲歌词和英语谚语献给干细胞研究同仁，以资共勉：
“敢问路在何方？路在脚下！”
“Where there is a will, there is a way.”
