|
第六章 植物的器官培养 目的要求： 1．一般掌握离体根培养的取材部位和培养基的选择 2．掌握茎尖培养的种类和操作步骤 3．掌握茎段培养中材料的选择、处理及培养基的调整 4．掌握离体叶片的培养步骤 5．一般掌握胚胎培养的类型与各自的注意事项 器官培养包括离体的根、茎、叶、花器和果实的培养。以器官作为外植体进行离体培养，是植物组织培养中最主要的一个方面，进行的植物种类最多，应用的范围也最广。器官培养不仅是研究器官生长、营养代谢、生理生化、组织分化和形态建成的最好材料和方法，而且在生产实践上具有重要的应用价值，如利用茎、叶和花器培养建立的试管苗，可在短期内提高繁殖速率，进行名贵品种的快速繁殖；利用茎尖培养可得到脱毒试管苗，解决品种的退化问题，提高产量和质量；将植物器官作诱变处理，用器官培养可得到突变株，进行细胞突变育种。 第一节 营养器官培养 一、 离体根培养 离体根培养是进行根系生理和代谢研究的最优良的实验体系，因为根系生长快，代谢强，变异小，加上无菌，不受微生物干扰，能根据研究需要，改变培养的成分来研究其营养吸收、生长和代谢的变化。另一方面，由根细胞可再生成植株，不仅证明根细胞的全能性，也产生了无性繁殖系，用于生产实践。培养方法如下： 1．培养基 多为无机离子浓度低的White培养基，其它培养基如MS、B5等也可采用，但必须将其浓度稀释到2/3或1/2。 2．根无性繁殖系的建立 将种子进行表面消毒，在无菌条件下萌发，待根伸长后从根尖一端切取长 3．植株再生培养? 根段的离体培养也可以用来再生植株。第一步诱导形成愈伤组织。第二步在再分化培养基上诱导芽的分化、在愈伤组织上分化成小植株。 二、 茎尖培养 茎尖培养是切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。这是组织培养中用得最多的一个取材部位。茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为微茎尖培养和普通茎尖培养。微茎尖指带有1～2个叶原基的生长锥，其长度不超过0.5mm。普通茎尖指较大的茎尖（如几mm到几十mm）、芽尖及侧芽。这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便，茎尖容易成活，成苗所需时间短。茎尖培养步骤如下： 1．取材 挑选杂菌污染少，生长不久的茎尖。木本植物可在取材前对茎尖喷几次灭菌药剂。以保证材料不带或少带菌。用于普通茎尖培养，可先从植物的茎、藤或匍匐枝上切取 2．消毒接种 将采到的茎尖切成0.5～ 3．接种 为了减少污染，可在接种前再剥掉一些叶片，使茎尖为 4．培养的方法和程序 （1）培养基：多数茎尖培养采用MS作为基本培养基或略加修改，或补加其它物质。常用的其它培养基有White,Heller等。 培养基中生长素是必须的，如2,4-D，IAA,NAA等，它们能有效地促进芽的生长发育，但是浓度不能太高，一般用0.1mg/L左右，高于此浓度，往往产生畸变芽或形成愈伤组织。但要注意不同植物对生长素的反应是不同的。 茎尖在培养过程中会出现生长太慢、生长太快和生长正常等三种类型。生长太慢即接种后茎尖不增大，只是茎尖逐渐变绿，出现绿色小点，细胞逐渐老化而进入休眠状态，或者逐渐变褐死亡。引起原因的是生长素浓度太低，或是温度过低或过高；生长太快型是接种后茎尖迅速增大，在茎尖基部产生愈伤组织，并迅速增殖，而茎尖不伸长，久之茎尖也形成愈伤组织，从而丧失发育成苗的能力。引起原因一是生长素浓度过高，引起细胞疯狂分裂而导致愈伤组织的形成。二是光照太弱或温度太高。生长正常型是接种后茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，茎尖颜色逐渐变绿，并逐渐伸长，叶原基发育成可见的小叶，进而形成小苗。 （2）培养条件 接种到培养基上的茎尖，置于培养室中培养，每天照光16小时，照度1500～3000Lx即可，温度通常在25±2℃。并且应根据不同植物种类，或者随培养过程的不同，给予适当的昼夜温差等处理。由于生长点培养时间较长，琼脂培养基易于干燥，这可以通过定期转移和包口封严等加以解决。一般茎尖培养在40天左右可长成新梢，进行继代培养。 （3）继代培养 茎尖长成的新梢，可切成若干小段，转入到增殖培养基中。一个月左右，新梢又可切成小段，再转入新培养基，这样一代一代继续下去，便建立和维持了茎尖无性系。继代培养可用MS0培养基。有时也可边进行继代培养边进行诱导生根。取比较长的新梢（如1cm以上）转入生根培养基，余下较短的新梢进行继代培养。 （4）诱导生根 诱导生根多采用1/2 MS培养基，即MS培养基的各种组成成份用量均减半的培养基。并加入一定的生长素类调节物质，如NAA 、IBA等。也可将切下的新梢基部浸入50或100ppm的IBA溶液处理4～8小时，然后转移到无激素的生根培养基中。注意较高浓度的生长素对生根有抑制作用。如果新梢周龄较大、木质化程度较高，则用IBA处理的时间应适当延长或其浓度提高。 5．移栽入土? 在生根培养一个月左右，多数新梢即可获得生长健壮而发达的根系。移植时可根据生根情况来进行。若发现新梢基部生有较浓密的不定根，长度在1cm以内，就可移栽入土。移栽时通过几天的炼苗过程，从试管中取出小植株，轻轻洗掉培养基，栽入塑料营养钵或育苗盘中，营养钵盛经烧烤或常压灭菌的培养土（1分腐殖土：1分沙）中。 栽后给予较高的空气湿度条件。首先营养钵的培养土要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭小拱棚，以减少水分的蒸腾，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当发现小苗有生长趋势，可逐渐减少湿度将拱棚两端打开通风，并且减少喷水次数。使小苗适应湿度较小的条件。以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，少浇水或不浇水，促进小苗长得粗壮。 温度管理上要掌握适宜的生根温度，最适宜的温度是16～20℃，春季地温较低时，可用电热线来加温。 光照管理上初期可用较弱的光照，在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加蒸腾作用，后期可直接利用自然光照。 为了提高驯化效率，可用育苗盘进行驯化生根、孔径选择2cm左右即可。孔穴装入蛭石：珍珠岩：草炭土为1:1:0.5的基质。当小苗长至5cm高左右再移入塑料营养钵中。 三、茎段培养 茎段培养指不带芽和带1个以上定芽或不定芽的，包括块茎、球茎在内的幼茎切段的无菌培养。培养茎段的主要目的是快繁。其次也可探讨茎细胞的生理，以及进行育种上的筛选突变体的过程。 茎段培养用于快速繁殖的优点在于：培养技术简单易行，繁殖速度较快；芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一；解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖问题等。 1．材料的选择和处理 取生长健壮无病虫的幼嫩枝条或鳞茎盘，若是木本，取当年生嫩枝或一年生枝条,剪去叶片，剪成3～4cm的小段。在自来水中冲洗1～3小时，于无菌条件下用75%酒精灭菌30～60秒，再用0.1%升汞浸泡3～8分钟，或用饱和漂白粉浸泡10～20分钟，因材料老嫩和蜡质多少而定时间。最后用无菌水冲洗数次，以备接种。取材时注意茎的基部比顶部切段，侧芽比顶芽的成活率低，所以应优先利用顶部的外植体，但由于每个新梢仅一个顶芽，也可利用腋芽，茎上部的腋芽培养效果较好。还应注意尽量在生长期取芽，在休眠期取外植体，成活率降低。如苹果在3～6月取材的成活率为60%，7～11月下降到10%，12～2月都在10%以下。 2．培养 最常用的基本培养基为MS培养基，加入3%蔗糖，用0.7%的琼脂固化。培养条件保持25℃左右，给予充分的光照和光期。经培养后茎段的切口特别是基部切口上会长出愈伤组织，呈现稍许增大，而芽开始长长，有时会出现丛生芽，从而得到无菌苗。 在茎段培养中，促进腋芽增殖用6-BA是最为有效的，依次为Kt和Zt等。生长素虽不能促进腋芽增殖，但可改善苗的生长。GA对芽伸长有促进作用。 继代扩繁是茎段培养的主要一步。这可由二种途径解决:一是促进腋芽的快速生长，二是诱导形成大量不定芽。第一种途径的好处是不会产生变异，能保持品种优良特性。且方法简便，可在各种植物上使用，每年从一个芽可增殖10万株以上。第二种途径会产生变异。 继代增殖过程所用培养基和生长调节剂与初代培养相同。 生根培养的目的是使再生的大量试管苗形成根系，获得完整的植株。创造适于根的发生和生长的条件，主要是降低或除去细胞分裂素而加入生长素。由于在苗增殖时施用了较高浓度的细胞分裂素，其苗中保持着一定的量，因此在生根培养中不需要加细胞分裂素。生长素的浓度，NAA一般0.1～1.0mg/L，IBA和IAA可稍高。 试管苗的生根，对基本培养基的种类要求不严，如MS、B5、White等培养基，都可用于诱导生根，但是其含盐浓度要适当加以稀释。前面的几种培养基中，除White外，都富含N、P、K盐，它们都抑制根的发生。因此，应将它们降低到1/2、1/3或1/4，甚至更低的水平。 生根培养时增强光照有利于发根，且对成功地移栽到盆钵中有良好作用。故在生根培养时应增加光照时间和光照强度，但强光直接照射根部，含抑制根的生长，所以在生根培养时最好在培养基中加0.3%活性炭，以促进生根。 3．移植 这是组织培养的关键一环。试管苗是在恒温、保湿、营养丰富、激素适当和无菌条件下生长的。植物的组织发育程度不佳，植株幼嫩，表皮角质层变薄，抵抗力减小减弱。移植是一个由异养转变为自养的过程。因此，在驯化时要进行炼苗。然后洗净琼脂，小心移栽，初期湿度要大，基质通气湿润，保湿保温，更要精心管理等。 四、离体叶培养 离体叶培养包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。它大多经脱分化形成愈伤组织，再由后者分化出茎和根。 叶是植物进行光合作用的自养器官，又是某些植物的繁殖器官，因此叶培养不仅可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题，而且也是繁殖稀有名贵品种的有效手段。 在自然界，很多植物的叶具有强大的再生能力，能从叶片产生不定芽的植物，以羊齿植物最多，双子叶植物次之，单子叶植物最少。再生成植株的方式有二种：一种是直接诱导形成芽，另一种是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化成植株，叶的离体培养技术如下： １．材料选择及灭菌? 取植物的幼嫩叶片冲洗干净，用70%酒精漂洗约10秒，再在饱和漂白粉液中浸3～15分钟，或在0.1%升汞中浸3～5分钟，用无菌水冲洗数次，再放在无菌的干滤纸上吸干水分，以供接种用。对一些粗糙或带茸毛的叶片要延长灭菌时间。注意要选择成熟的叶片。一般地说，同一叶片的栅栏组织比海绵组织处于较成熟状态。在培养叶肉时因为海绵组织在分裂前就死亡，如果栅栏组织不发达的话就难于培养。 2．接种 把灭菌过的叶组织切成约0.5cm见方小块或薄片（如叶柄和子叶），接种在MS或其它培养基上。培养基中附加BA1～3mg/L，NAA0.25～1mg/L。 ３．培养? 叶接种后培养条件为每天10～12小时光照，光强1500～3000Lx。培养约2周至4周，叶切块开始增厚肿大，进而形成愈伤组织。这时应转移到再分化培养基上进行分化培养，分化培养基的细胞分裂素含量为2mg/L左右，约10天左右，愈伤组织开始转绿出现绿色芽点，它将发育成无根苗。若再将苗移至含NAA0.5～1mg/L的生根培养基可诱导成根，从而发育形成完整植株。 叶的培养比胚，茎尖和茎段培养难度大。首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶易培养，子叶比叶片易培养。其次要添加适当的生长素和细胞分裂素，保证利于叶组织的脱分化和再分化。 第二节 生殖器官培养 一、 花器官和种子培养 （一）花器官培养 花器官培养指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。子房和花药培养另有专门叙述，不再重复。 花器培养无论在理论研究和生产应用上都有重要价值。通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在花芽性别决定中所起的作用。可以了解花器各部分对果实和种子发育的作用，以及内、外源激素在果实种子发育过程中的调控作用。生产上可用于珍贵品种的扩大繁殖。培养方法如下： 1．取材 从健壮植株上取未开放的花蕾，已经开花的不宜用，因为消毒困难。先用75%酒精消毒约30秒钟，再用饱和漂白粉浸10～15分钟，取出用无菌水冲洗数次。 2．接种培养 用整个花蕾培养时，只要把花梗插入培养基中。若用花器的某个部分，则分别取下，切成小片，放入培养基中。常用的培养基有MS、B5等。若要把花器官部分培育成小植株，要加入生长激素和细胞分裂素，诱导形成愈伤组织或胚状体，再分化培养成植株。如菊花的花瓣片接在含6-BA 2mg/L、NAA 0.2的MS培养基上，在26℃1500Lx光照，每天光照10小时，培养约2周，形成少量愈伤组织。再经1个月就分化出绿色芽点，再切割转接，可形成大量无根苗，经长根成植株，用于繁殖。 （二）种子培养 种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成熟种子的无菌培养。早在1754年，Bonnet使不具子叶的蚕豆种子在无菌条件下培养萌发。到1904年，Hanning在无菌条件下培养胡萝卜不同发育时期的种胚，获得种子苗。随后这项技术广泛地应用于花卉、蔬菜、果树、农作物等的种子培养之中。利用种子培养可以打破种子休眠，特别对一些休眠期长的植物；可以作为大量生产试管苗的好材料，它具有植株分化容易，无菌操作方便等特点。可使远缘杂交产生的杂种败育种子，正常萌发产生第二代植株。培养技术如下： 1．种子灭菌? 种皮厚或不饱满的种子，宜用0.1%升汞消毒10～20分钟。幼嫩的或发育不全的种子，宜用饱和漂白粉消毒15～30分钟。若种子上有绒毛或蜡质，应先用95%酒精或吐温40处理，提高消毒效果。对壳厚难萌发的种子，可去壳培养。 2．培养基? 若以促进种子萌发为目的种子培养，培养基的成分要求较简单，可不加或少加生长激素。当然，对某些发育不全的无胚乳的种子培养，应提供适当的生长激素。种子培养的糖浓度可稍低，一般1～3%。 3．接种培养? 种子培养的接种较容易，把种子按每瓶3～5粒放入培养瓶中，均匀排列，放在20～28℃的条件下培养，1000～2000Lx光强，每天光照10小时。 二、 胚胎培养 植物胚胎培养是胚及胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌条件下，使胚发育成幼苗的技术。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。 胚胎培养已有近百年的历史，1904年的Haning最早成功地培养了萝卜和辣椒的胚，并萌发形成小苗。30年代成功地把兰科植物的胚培养成小植株。40年代在苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养均取得了不同程度的进展。 （一）胚胎培养的意义 １．克服远缘杂种的不育性? 在高等植物的种间和属间胚败育，胚发育不全而不能正常萌发，因而得不到杂种种子，用胚胎培养和试管受精技术就可以解决这些问题。 ２．使胚发育不全的植物获得后代 如兰花、天麻的种子成熟时，胚只有6～7个细胞，多数胚不能成活。如在种子接近成熟时，把胚分离出来进行培养，就能生长发育成正常植物。 ３．缩短育种年限 在杂交育种中，应用胚培养技术可以缩短育种周期1～2年。 （二）离体胚培养 植物在受精后，受精卵形成合子，随即进行第一次分裂，进而形成分生组织和幼胚，再发育成成熟胚。在这个过程，胚靠消耗胚乳的营养而发育，同时胚处在胚囊环境中，可吸收氨基酸、维生素等营养。离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，一般可分为成熟胚和幼胚培养。 １．成熟胚培养? 成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。它培养较易成功，在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。由于种子外部有较厚的种皮包裹，不易造成损伤，易于进行消毒，因此，将成熟或未成熟种子用70%酒精进行几秒钟的表面消毒，再用无菌水冲洗3～4次，然后在无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养上培养。 ２．幼胚培养? 幼胚是指子叶期以前的幼小胚，由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，因此，其研究和应用越来越深入和广泛。随着组织培养技术的不断完善，幼胚培养技术也在进步，现在可使心形期胚或更早期的长度仅0.1～0.2mm的胚生长发育成植株。由于胚越小就越难培养，所以，尽可能采用较大的胚进行胚养。现在幼胚培养成功的有大麦、荠菜、甘蔗、甜菜、胡萝卜等。 幼胚培养的操作方法同成熟胚培养基本相同，注意的是切取幼胚必须在高倍解剖镜下进行，操作时要特别细心，尽量取出完整的胚。在未成熟胚胎的培养中，常见有三种明显不同的生长方式，一种是继续进行正常的胚胎发育，维持“胚性生长”；另一种是在培养后迅速萌发成幼苗，而不继续进行胚性生长，通常称为“早熟萌发”；第三种是在很多情况下，胚在培养基中能发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。特别是加有生长调节剂时，就更为如此。 幼胚培养成功的关键，是提供幼胚所必需的营养和环境条件。影响条件如下： 1.培养基? 成熟胚对培养基要求不高，而幼胚要求较高，常用的培养基有Tukey、MS、B5、Nitsch培养基，其中前者适于成熟胚培养，其它适于未成熟胚和幼胚培养。 幼胚需要较高的蔗糖浓度，提供较高的渗透压。由于幼胚在自然条件下赖以生存的是无定形的液体胚乳，具有较高的渗透压，人工培养基中要创造高渗透压的条件，它可以调节胚的生长，阻止可能的渗透压影响，还能抑制中早熟萌发中的细胞延长，以及抑制胚的萌发，避免把细胞的伸长状态转化为分裂状态。 2.生长调节物质? 不同植物的胚培养需要的生长物质不同，如IAA可明显促进向日葵胚的生长。IAA,Kt的共同作用可促进荠菜幼胚的生长。一般认为IAA可使胚的长度增加；加入BA可提高胚的生存机会。 将荠菜胚培养在一种简单的渗透压未调整的无机盐培养基中，用生长调节物质或增加蔗糖或主要盐类的浓度，能诱导更小的胚的生长，这暗示渗透压与生长调节物质的复杂作用。显然，高渗透压的控制和生长调节物质的化学调节，应通过某种方式联系起来。可能在平 衡的激素控制系统中，一种或几种成分的活性，依次被高浓度的蔗糖或高浓度盐所控制，也许通过渗透过程阻止细胞伸长。 3.天然提取物的作用 椰乳对胚培养有一定的促进作用，如番茄胚在含有50%椰乳的培养基中可维持生长。另外对胡萝卜幼小子叶阶段的离体胚培养，也有促进作用。 还有一些瓜类的胚乳提取物能促进胚生长的能力，可能是植物激素的细胞分裂物质和一些有机氮化合物作用的结果。 4.温光条件? 对于大多数植物的胚来说，在25～30℃为宜，但是，早熟果树如桃的种胚，必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长，而马铃薯胚以20℃为好。 光照可以促进某些植物的胚转绿，利于胚芽生长，而黑暗利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利。 5.其它条件? 胚培养中除要求较高的蔗糖浓度、高渗透压以外，还要求较高浓度的氨基酸及无机盐。 三、胚珠培养 胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后，取胚珠置于培养基培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。胚珠培养可以解决象兰科植物成熟胚较小不易培养的问题。另一方面在未受精的胚珠培养中，可诱发大孢子发育成单倍体，用于单倍体育种。 培养时，从花中取出子房进行表面消毒，在无菌条件下进行解剖，取出胚珠，放在培养基上培养，基本培养基多用Nistch培养基，不过诸如MS、N6、B5等培养基也可采用。 从胚珠培养成植株的关键是选择胚的发育时期，实验证明发育到球形胚期的胚珠较易培养成功。另外为了培养成功，可取用带胎座甚至带部分子房的胚珠进行培养。 四、胚乳培养 胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的三倍体组织。由它可获得无子结实的三倍体植株，进而可将它加倍成六倍体植株。 取授粉4～8天后的幼果，常规消毒后，在无菌条件下切开果实，取出种子，小心分离出胚乳。接种在培养基上，可用MS、White等 ，加入2，4-D或NAA0.5～2.0mg/l，BA0.1～1.0 mg/l。 在25～27℃和黑暗条件或散射光下培养,约6～10天胚乳开始膨大,再培养形成愈伤组织.这时应转到分化培养基上培养,分化培养基可加入0.5～3.0 mg/l的BA及少量的NAA。待愈伤组织长出芽后,切下不定芽,插入生根培养基中，光下培养10～15天,切口处可长出白色的不定根。 本章小结 1．植物器官培养是组织培养当中一个最重要的方面，应用范围最广泛。它是指植物离体的根、茎、叶、花、果和种子的无菌培养。 2．根培养不仅可以很方便地研究根的生理代谢，而且利用White培养基也能再生成幼小植株。 3．花培养是指整个花器官或花的组成部分之一的无菌培养，基本培养基一般用MS或B5。 4．种子无菌培养操作简便，植株分化容易，可以一定程度上克服育种上远缘杂交的不育性。 5．胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养和胚乳培养等。具有以下意义：（1）克服远缘杂种的不育性，（2）使胚胎发育不完全的植株获得后代，（3）缩短育种年限，提高育种效率。 复习思考题 1．为什么说植物器官培养是组织培养的一个最重要的方面？器官培养包括哪些类型？ 2．植物的离体根培养有何意义？ 3．普通茎尖培养时，怎样取材和处理外植体？茎尖培养过程中会出现什么现象？怎样解决？ 4．茎段培养与茎尖培养有什么主要区别？ 5．花器官培养通常指花的哪些部分培养？常用的基本培养基是什么？ 6．植物胚胎培养分为哪些类型？各有何特点和要求？胚胎培养有何重要意义？ |
|
|
