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绪 论 1、植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养。 2、无菌：是指使培养皿、器械、培养基和培养材料等处于无真菌、细菌、病毒等微生物的状态，以保证培养材料在培养器皿中正常生长发育。 3、外植体：植物组织培养中，使用的各种器官、组织和细胞统称为外植体。 4、愈伤组织：是指外植体因受伤或在离体培养时，其未分化的细胞和已分化的细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。 5、组织培养的特点 （1）整个过程无菌 （2）多数利用成分完全确定的人工培养基，植物材料处于异养 （3）培养材料可以是器官、组织、细胞，处于离体状态，在不同水平表现细胞全能性 （4）可形成克隆，或达到其他目的 （5）在封闭容器中进行 （6）环境温度、光照都是人为设定 6、组织培养的研究类型 （1）组织培养 （2）器官培养 （3）胚胎培养 （4）细胞培养 （5）原生质体培养 7、植物组织培养的应用 n 植物离体繁殖 n 无病毒苗木培育 n 培育新品种或创制新物种 n 次生代谢物生产 n 植物种质资源的离体保存 n 人工种子 8、植物组织培养的形成与发展
第一章 实验室及基本操作 1、常用的灭菌方法 n 高压蒸汽灭菌 n 干热灭菌 n 化学药剂灭菌 n 紫外灯灭菌 n 过滤除菌 2、高压蒸汽灭菌法
3、无菌操作
4、培养基的构成 （1）水分 （2）无机盐类 l 铁盐 （3）有机营养（糖、维生素、氨基酸） （4）植物生长调节剂 l 生长素：IAA IBA NAA 2,4-D l 细胞分裂素：KT ZT 6-BA TDZ 2-ip （5）天然有机添加物 （6）pH（5.0-6.0） （7）凝固剂（琼脂） 5、培养基的基本类型 （1）含盐量较高的培养基：其代表是MS培养基。无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾离子和铵离子含量丰富；元素平衡较好，缓冲性能好；微量元素和有机成分含量齐全且较丰富。 （2）硝酸钾含量较高培养基：培养基的盐浓度高，铵态氮含量较低，但盐酸硫胺素和硝酸钾含量较高。 （3）中等无机盐含量的培养基：大量元素含量约为MS培养基的一半，微量元素种类少但含量较高，维生素种类较多。 （4）低无机盐含量的培养基：无机盐含量非常低，为MS培养基的1/4左右，有机成分也很低。 6、培养基配制
7、外植体的选择原则
8、常用的灭菌药剂 酒精 次氯酸钠 氯化汞 9、植物材料灭菌的一般过程 （1）材料前处理 （2）灭菌剂配制 （3）材料灭菌 10、培养条件 （1）光照
（2）温度 一般控制在25±2℃恒温条件下培养。 （3）湿度 组织培养室内的相对湿度，保持在70-80% 第二章 植物组织培养的基本原理 1、植物细胞全能性 每一个植物细胞都带有该植物的全部遗传信息，在适当条件下可表达出该细胞的所有遗传信息，分化出植物有机体所有不同类型的细胞，形成不同类型的器官甚至胚状体，直至形成完整再生植株。 2、细胞分化 是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。 3、脱分化 也称去分化，是指离体培养条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分手状态，形成无组织结构的细胞团或成为未分化细胞特性的细胞的过程。 4、再分化 离体培养的周五细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株，这个过程称为再分化。 5、利用离体培养技术已揭示的细胞分化的规律和机理。 （1）细胞分化基本分为形态结构分化和生理生化分化 （2）发育植物中不存在部分基因组永远关闭的情况 （3）在完整植株中，细胞发育途径一旦被“决定”，通常不易改变，但离体培养可以通过脱分化而丧失“决定” （4）极性与分化关系密切 （5）生殖隔离或机械隔离在细胞分化中的促进作用 （6）细胞分裂对细胞分化具有重要作用 （7）植物生长调节剂在细胞分化中有明显的调节作用 （8）细胞核染色体和DNA的变化对细胞分化的作用 6、再生植株的途径 器官发生和胚胎发生 7、影响细胞脱分化的因素 （1）损伤 （2）生长调节剂 （3）光照 （4）细胞位置 （5）外植体的生理状态 （6）植物种类差异 8、愈伤组织形成 （1）诱导期 （2）分裂期 （3）分化期 9、愈伤组织生长过程发生的生理生化变化 （1）RNA先增加后减少 （2）同工酶谱发生变化 （3）连续继代培养可能改变次生物质的积累水平或能力 （4）可能出现驯化现象 10、胚状体 在离体培养条件下，植物离体培养的细胞、组织、器官也可以产生类似胚的结构，其形成也经历一个类似胚胎的发生和发育过程，这种类似胚的结构称为胚状体。 11、体细胞胚胎发生过程 原胚 球形胚 心形胚 鱼雷形胚 成熟胚 12、植物体细胞胚胎发生的生理生化变化 （1）蛋白质和核酸 （2）多胺代谢 （3）糖类、金属离子和微量元素 （4）内源激素 （5）活性氧 13、影响植物离体形态发生的因素 （1）植物种类和基因型 （2）培养材料的生理状态 ① 植株的发育年龄 ② 培养器官或组织类型 ③ 培养时间和细胞倍性 （3）培养基 ①植物营养 ②植物生长调节剂 ③物理性质 （4）培养条件 ①光（光照强度、光照长度、光质） ②温度 第三章 植物器官和组织培养 1、植物器官培养 是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。 2、植物器官和组织培养的基本程序 （1）无菌外植体的获得 ①茎尖、茎段、叶片的灭菌 ②根、块茎、鳞茎的灭菌 ③花蕾的灭菌 ④果实、种子的灭菌 （2）初代培养物的建立无菌环境 ①规范操作 ②条件合适 （3）形态发生和植株再生 （4）培养产物的观察记载 ①愈伤组织 ②胚状体 ③芽 ④根 3、茎段培养获得产物 l 单苗（芽） l 丛生苗（芽） l 完整植物 l 愈伤组织 4、叶培养获得产物 l 不定芽或胚状体 l 愈伤组织 l 成熟叶 5、条件化效应 从离体培养的植物上取得的外植体已具有了被促进的形态发生能力。 6、花器官培养获得产物 l 成熟果实 l 不定芽或丛生芽 l 愈伤组织 7、种子培养获得产物 l 小植株 l 愈伤组织 l 丛生芽或不定芽 8、茎尖培养 是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。茎尖培养的材料可以是10-100um的茎尖分生组织，也可以是几十毫米的茎尖或更大的芽。 9、植物分生组织培养 是指对植物的分生组织进行离体培养的技术，包括植物根尖、茎尖等顶端分生组织和形成层组织的培养。 10、茎尖培养获得产物 l 芽萌发 l 产生胚状体 l 产生不定器官 l 形成愈伤组织 11、茎尖离体培养后可能的培养反应 ①生长太慢 ②生长过旺 ③生长正常 第四章 植物胚胎培养及离体授粉 1、胚培养的类型 幼胚、成熟胚 2、胚培养的应用 ①克服远缘杂交不亲和性 ②打破种子休眠，缩短育种周期 ③提高种子萌发率 3、胚珠培养的意义 ①使杂种尽早培养，防止杂胚早期败育，获得杂种植株 ②通过受精前胚珠培养以及未受精的胎座或子房培养，可以作为试管受精的基础 ③未受精的胚珠培养能和花药培养一样，诱导出大孢子或卵细胞增殖，形成单倍体，用于单倍体育种 4、子房培养的意义 ①使未受精胚囊中的单倍性细胞诱导发育成单倍体植株 ②获得杂种植株 ③为试管受精提供一项基础技术 5、离体授粉 是指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术，又称为离体受精或试管受精。 6、离体授粉的程序 （1）确定开花、花药开裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精的时间 （2）去雄后将花蕾套袋隔离 （3）制备无菌子房或胚珠 （4）制备无菌花粉 （5）胚珠（或子房）的试管内受精 第五章 植物花药和花粉培养 1、花药和花粉培养的概念 l 诱导花粉细胞发育成单倍体植株 l 花药培养属于器官培养的范畴 l 花粉培养属于细胞培养的范畴 l 花粉培养具有一定优越性 2、花粉和花药培养的应用 （1）作物育种 （2）物种进化研究 （3）遗传分析 （4）分子生物学 （5）植物基因克隆筛选 3、雄核发育途径 （1）A途径 ① A-V途径 ② A-G途径 ③ A-VG途径 ④ C途径 （2）B途径 4、花粉分离方法 （1）自然散落发 （2）挤压法 ① 挤压法 ② 研磨过滤收集法 （3）机械游离法 ① 磁搅拌法 ② 小型搅拌法 5、花粉培养方式 l 平板培养 l 看护培养 l 液体培养 l 双层培养 l 微室培养 l 条件培养基培养 6、影响雄核发育的影响因素 （1）基因型 （2）植株生长条件和生理状态 （3）花粉发育时期 ①花粉粒发育时期的观察 ②花粉发育时期的确定 （4）预处理 ①高低温处理 ②化学物质处理 a高糖 b甘露醇 c秋水仙素 d乙烯利 ③其他 a γ射线 b离心 c磁场 （5）培养基 ①基本培养基 ②碳源 ③氨基酸和其他有机物质 ④植物激素 ⑤活性炭 ⑥pH （6）培养条件 ①温度 ②光照 ③植板密度 （7）花药壁因素 7、花粉和花药植株的倍性鉴定 （1）染色体直接计数法 （2）间接鉴定 ① 扫描细胞光度仪鉴定 ② 细胞形态学鉴定法 ③ 植物形态学鉴定法 ④ 高/低温胁迫法 ⑤ 杂交鉴定法 ⑥ 分子标记鉴定法 8、花粉和花药植株的染色体加倍 ①茎段培养 ②化学试剂诱变 a秋水仙素诱导 b除草剂诱导 第六章 植物细胞培养 1、单细胞培养 就是对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直至长成完整植株的技术。 2、人工种子 又称合成种子，一般是指离体培养条件下的植物材料，通过繁殖获得大量的高质量的成熟胚状体，把这些胚状体外面包上有机化合物作为保护胚状体及提供营养的“种皮”，从而创造出与真种子类似的结构。 3、分批培养 是指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。 4、单细胞培养方法 （1）平板培养 （2）看护培养 （3）微室培养 （4）条件培养基培养 5、悬浮细胞培养方法 （1）分批培养 延滞期 对数增长期 直线生长期 缓慢期 静止期 （2）半连续培养 （3）连续培养 l 封闭型连续培养 l 开放型连续培养（浊度恒定、化学恒定） 6、悬浮培养中细胞生长的测定 l 细胞计数 l 细胞总体积及细胞密实体积 l 细胞鲜重和干重 l 细胞有丝分裂指数 l 细胞植板率 7、人工种子的优点 （1）使自然条件下不易结实或种子昂贵的材料能够快速繁殖和保存 （2）繁殖速度快 （3）固定杂种优势，可使F1杂种优势多代利用 （4）为基因工程技术应用于生产提供桥梁 （5）在人工种子的制作中，加入各种营养成分或生长调节剂，调节植物生长，提高植物抗性 （6）在一定程度上可取代天然种子而节约粮食，贮运方便，可播种育苗 第七章 植物原生质体培养及细胞融合 1、原生质体融合 是指通过物理或化学方法使原生质体融合，经培养获得具有双亲全部（或部分）遗传物质的后代的方法，亦称体细胞杂交。 2、细胞质工程 又称细胞拆合工程，是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核、质的重新组合，重建成新细胞。 3、微原生质体融合技术 又称微核技术，是指以植物细胞经微核化处理后形成的、外包有被膜、内含一条或几条染色体的微核作为供体，与受体原生质体融合，从而实现部分基因组转移的技术。 4、影响原生质体数量和活力的因素 （1）供试材料 （2）酶的种类、组合和酶解时间 （3）渗透压稳定剂 （4）质膜稳定剂 （5）pH 5、原生质体培养方法 （1）平板培养法 优点：原生质体分布均匀，有利于分裂；容易获得单细胞株系；可定位观察单个原生质体的生长发育情况 缺点：原生质体易受热伤害；易破碎；原生质体始终处在高渗透压胁迫下，生长发育缓慢，植板率低 （2）液体浅层培养法 优点：操作简单，对原生质体伤害小；可微量培养；能及时降低渗透压并补加新鲜培养基，细胞植板率高 缺点：原生质体沉淀，分布不均匀；形成的细胞团聚集在一起，难以选出单细胞无性系 （3）固-液结合培养法 优点：原生质体分布均匀，有利于分裂；容易获得单细胞株系；因能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高 缺点：原生质体易受热伤害；易破碎 6、影响原生质体培养的因素 （1）原生质体活力 （2）原生质体起始密度 （3）渗透压稳定剂 （4）培养基成分 ①基本培养基 ②碳源 ③无机盐浓度和氮的形态 ④植物生长调节剂的浓度配比 （5）培养条件 （6）植物材料和基因型 7、原生质体融合类型 l 对称融合 l 不对称融合 l 微原生质体融合 8、融合产物的类型 l 异核体 l 多核体 l 同核体 l 异胞质体 9、电融合法的操作过程 （1）制备原生质体 （2）调整融合参数，设定好电场强度高频信号、处理时间等 （3）融合处理，等量混合原生质体，滴入融合槽内，施加高压脉冲，使原生质体发生极化、排列、膜穿孔、闭合、融合 （4）离心洗涤 （5）融合体培养 10、融合体的发育过程 l 细胞壁再生 l 核融合 l 细胞增殖 11、杂种细胞选择 （1）互补筛选法 ①激素自养型互补选择 ②白化互补选择 ③营养缺陷型互补选择 ④抗性突变体互补选择 ⑤基因互补选择 （2）机械筛选法 ①天然颜色标记分离 ②荧光素标记分离 ③荧光活性自动细胞分类器分类融合体 12、杂种植株的选择 l 形态学鉴定 l 细胞学鉴定 l 生物化学鉴定 l 分子生物学鉴定 第八章 植物体细胞无性系变异 1、体细胞无性系变异 是指培养物在培养阶段发生变异，进而导致再生植株亦发生遗传改变的现象。 2、外遗传变异 也称发育变异，即由于外部影响导致基因表达的改变，从而引起表型上的变异。 3、体细胞变异的特点 （1）优点 ①适用于各种可进行组织培养的作物 ②持续快速提供变异源 ③消除优良品种的一个或几个缺陷 ④提供新型变异株系 （2）缺点 ①继代培养多次后，植株再生能力减弱 ②一些变异经自交或杂交后表现不稳定 ③变异没有可预见性，会产生一些不符合育种需要的变异 4、影响体细胞无性系变异的因素 （1）外植体 （2）物种和基因型 （3）培养基 ①基本培养基 ②植物生长调节剂 （4）继代培养时间 5、植物体细胞无性系变异的机理 （1）预先存在的变异表达 （2）染色体数目变化 （3）点突变 （4）体细胞染色体交换及姐妹染色单体交换 （5）DNA复制和缺失 （6）转座因子的活化 （7）DNA甲基化 （8）胞质DNA的变化 （9）外遗传变异 第九章 植物离体繁殖 1、植物离体繁殖 又称植物快繁或微繁，是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。 2、褐化 是指培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基和培养材料逐渐变褐而死亡的现象。 3、污染：是指在组培过程中，由于真菌、细菌等微生物污染，在培养容器中滋生大量菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。 4、玻璃化：是试管苗的一种生理失调症状，表现为试管苗叶片、嫩梢呈水浸透明或半透明状。 5、植物快繁特点 （1）繁殖效率高 （2）培养条件可控性强 （3）占用空间小 （4）管理方便 （5）便于种质保存和交换 6、植物快繁的器官形成方式 l 短枝发生型 l 丛生芽发生型（最普遍） l 不定芽发生型 l 胚状体发生型（速度最快） l 原球茎发生型（兰科植物） 7、植物快繁的程序 （1）阶段I 无菌培养的建立 ①母株和外植体的选取 ②无菌培养物的获得 ③外植体的启动生长 （2）阶段II 繁殖体增殖 ①培养材料的增殖 ②增殖培养基 ③增殖体的大小和切割方法 （3）阶段III 芽苗生根 ①离体生根 ②活体生根 （4）阶段IV 小植株的移栽驯化 ①移栽 ②驯化管理 8、影响植物快繁的因素 （1）外植体 ①外植体的来源 ②外植体生理年龄 ③外植体大小 （2）培养基 ①基本培养基 ②植物生长调节剂 ③培养基的物理特性 （3）培养条件 ①光照 ②温度 ③湿度 ④气体 （4）继代培养 （5）移栽 ①根系结构 ②叶表皮组织 9、试管苗的根系结构 （1）不生根，可采用嫁接法解决 （2）根与输导系统不连接，可将芽切割下来转移到生根培养基中，重新诱导根的形成 （3）根无根毛或很少，将小苗移栽前置入液体培养基中培养，有时可促进根毛发育 （4）根无吸收功能或极低，移栽前将试管苗在培养液中培养一段时间，可恢复根的吸收功能 10、试管苗的叶组织特征 ①叶表角质层和蜡质层不发达或无 ②叶无表皮毛或极少 ③叶解剖结构稀疏 ④气孔开张大，不关闭 ⑤叶片存在排水孔 ⑥光合作用能力极低 11、试管苗商业化生产成本 ①人工费用 ②生产物资费用 ③设备折旧费用 ④水电费用 ⑤其他费用 12、降低商业化成本的措施 ①提高劳动生产率 ②减少设备投资，延长使用寿命 ③降低消耗 ④降低污染，提高繁殖率和成活率 ⑤简化培养基 13、污染 （1）原因 ①培养基及各种接种器皿灭菌不彻底 ②外植体灭菌不彻底 ③操作时人为带入 ④环境不清洁 ⑤超净工作区不清洁 （2）控制措施 ①灭菌前充分排尽灭菌锅内冷空气，灭菌温度121-126℃，灭菌时间20-30min ②接种器具每次使用后应用酒精灼烧 ③污染的外植体应及时淘汰，如果种源有限可进行二次消毒 ④操作人员接种时应用75%酒精擦拭双手和培养瓶表面，操作区内不要放入过多待用培养瓶 ⑤接种环境定期用福尔马林等熏蒸灭菌，经常用紫外灯灭菌 ⑥超净工作台应定期对初滤器清洗和更换，提前15-20 min打开，并用75%酒精擦拭整个工作台 14、遗传稳定性 （1）影响因素 ①基因型 ②继代次数 ③器官发生方式 （2）降低变异措施 ①选用不易发生遗传变异的基因型材料 ②缩短继代时间，限制继代次数 ③采用不易发生遗传变异的增殖途径 ④采用适当的生长调节剂物质和较低的浓度，减少或不使用易引起诱变的物质，及时剔除生理和形态异常苗 15、玻璃化 （1）原因 ①培养基的琼脂和蔗糖浓度 ②培养温度 ③生长调节剂浓度 ④培养瓶中乙烯浓度 ⑤光照 ⑥培养基含氮量 （2）防止措施 ①提高培养基硬度，降低培养基水势 ②提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基渗透压 ③利用可透气性瓶塞材料，降低培养瓶中过高过饱和湿度 ④减少培养基中含氮化合物、生长调节剂的用量 ⑤增加光照强度，适当降低培养温度，并进行昼夜变温处理 ⑥一些添加物或抗生素可减少或防止玻璃化发生 16、褐化 （1）原因 ①植物种类和品种 ②外植体年龄、大小和取材时间 ③外植体损伤 ④光照 ⑤温度 ⑥培养时间过长 ⑦培养基成分 （2）防止措施 ①在冬春季节选择适当的外植体，即外植体应具有较强分生能力 ②选择适宜的培养基，调整激素用量 ③控制温度和光照 ④培养基中添加抗氧化剂和其他抑制剂或吸附剂 ⑤加快继代转瓶速度 17、黄化 （1）影响因素 ①培养基成分 ②培养条件 ③pH ④抗生素类 （2）控制措施 ①检查培养基配制过程，保证培养基成分正确添加 ②调节培养基组成和pH ③控制培养室温度，增加光照，改善瓶内通气情况 ④减少或不用抗生素物质 第十章 无病毒苗培育 1、植物脱病毒的机理 （1）植物病毒自身不具有主动转移到能力，无论在病田植株间还是在病组织内，病毒的移动都是被动的 （2）在旺盛分裂的细胞中，代谢活性很高，使病毒无法复制 （3）在植物体内可能存在着病毒钝化系统，在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性 （4）茎尖中存在高水平内源激素，可抑制病毒增殖 2、植物脱毒方法 （1）物理方法：热水或热空气处理 （2）化学方法 （3）生物学方法 ①茎尖组织培养脱毒法 ②愈伤组织培养脱毒法 ③微体嫁接离体培养脱毒法 ④珠心组织培养脱毒法 （4）综合脱毒法 ①茎尖培养结合热处理脱毒法 ②茎尖培养结合病毒钝化剂处理脱毒法 3、脱病毒植株的检测 l 直接测定法 l 指示植物法 l 血清鉴定法（酶联免疫吸附法） l 核酸分析法 l 电镜鉴定法 4、脱病毒植株保存 l 在温室或防虫罩内 l 大规模繁育生产用种，可在田间隔离区进行 l 签定脱毒苗的遗传稳定性 5、脱病毒植株的繁殖和应用 （1）繁殖 ①脱病毒植株继代培养快繁 ②快繁苗的生根及微型鳞茎（或微型小薯、原球茎）的培养 （2）应用 ①研究特定病毒对寄主植物的影响 ②用于种质材料的保存和良种生产 · 脱毒苗的培育 · 原原种的生产 · 一级原种生产 · 二级原种生产 · 一级种薯生产 · 二级种薯生产 第十一章 植物种质资源离体保存 1、种质资源离体保存 是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。 2、种子保存的局限性 ①种子生活力随贮存期的延长会逐渐丧失 ②无性繁殖的植物难于采用种子保存 ③采用无性繁殖来保持性状的植物，用种子繁殖后代会发生变异 ④顽拗型种子植物不宜用种子保存或保存难度大 ⑤易遭受自然灾害袭击而丢失 3、离体种质保存的特点 （1）优点 ①占用空间少，节约大量的人力、物力和土地 ②便于种质资源的交流利用 ③需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖 ④避免自然灾害引起的种质丢失 （2）缺点 ①对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续继代培养 ②易受微生物污染或发生人为差错 ③多次继代培养有可能造成遗传变异及材料的分化和再生能力的逐渐丧失 4、限制生长保存 （1）低温保存法 （2）高渗透压保存法 （3）生长抑制剂（或延缓剂）保存法 （4）降低氧分压保存法 （5）干燥保存法 5、超低温保存的基本原理和操作程序 （1）基本原理 （2）操作程序 ①植物材料（培养物）的选取 ②材料预处理 ③冷冻处理 慢冻法 快冻法 预冻法 干冻法 ④冷冻贮存 ⑤解冻 a快速解冻 b慢速解冻 ⑥再培养 |
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