山药多糖治疗糖尿病药效学研究山药多糖治疗糖尿病药效学研究山药多糖治疗糖尿病药效学研究山药多糖治疗糖尿病药效学研究

山药多糖治疗糖尿病药效学研究山药多糖治疗糖尿病药效学研究山药多糖治疗糖尿病药效学研究山药多糖治疗糖尿病药效学研究 姓名姓名姓名姓名：：：：汪岩汪岩汪岩汪岩   学号学号学号学号：：：：S2010210   专业专业专业专业：：：：中药学中药学中药学中药学 山药又称“食物药”，《本草纲目》记载，山药有益肾气、健脾胃、止泻痢、润皮毛的作用，我国第一部医学巨献《神农本草经》，将山药列为上品，认为它有补虚，除寒热邪气，长肌肉，久服耳聪目明的功能。国内外对山药功能性成分的报道很多，目前研究的最多的是 山药中最主要的药用成分山药多糖，山药多糖是从山药块茎中提取的一种有效成分，其含量约为2．15％～2．92％。有研究证实，山药多糖具有多种药理作用，如降血糖、抗衰老、增强免疫功能、抗突变、 抗肿瘤、抗氧化作用等[1~5]。据报道多糖可分为酸性多糖与中性多糖两类，由甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成，国外有报道称 山药多糖中还含有一定量的甘露聚糖[6]。对于山药多糖的降血糖作用，国内外的研究仅停留在其有降低血糖和刺激胰岛素分泌的层面[7,8]，对于其具体的降糖机制的研究尚无文献报道。 1    山药多糖的提取山药多糖的提取山药多糖的提取山药多糖的提取 取山药药材500g，加水冷浸12h，水煎煮1.5h，两次，合并水煎液，加入2%新鲜配制的淀粉酶溶液于60℃保温5min，目的是出去淀粉。再进行抽滤，滤液浓缩至体积为500ml，以95%乙醇醇沉至含醇量为80%，静置过夜，抽滤，滤渣依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，50℃真空干燥既得山药多糖（粗多糖）。 ２２２２ 实验动物分组与造模实验动物分组与造模实验动物分组与造模实验动物分组与造模 2.1实验动物分组 取健康Wistar大鼠,随机分为6组分组情况如表1.                                表1. 组别              状况 第一组  正常对照组 普通饲料喂养 等体积蒸馏水灌胃 第二组  糖尿病模型组 等体积蒸馏水灌胃 第三组  山药多糖低剂量用药组（40mg/kg） 第四组  山药多糖中剂量用药组（70mg/kg） 第五组  山药多糖高剂量用药组（100mg/kg） 第六组  阳性对照组 二甲双胍（100mg/kg） 2.2动物造模及处理 将健康大鼠先于温度25℃，相对湿度50%~60%室内适应一周。第一组灌服等体积蒸馏水；第二~六组给予高热量饲料8周后，一次性尾静脉注射小剂量35mg／kg STZ[STZ用 0．1mol／L柠檬酸一柠檬酸钠溶液(PH4．0)稀释成l％的溶液]，注射72h后，测定空腹血糖稳定在13．5mmol／L以上者为造模成功。造模成功后第二组灌服等体积蒸馏水；对三~六组分别给予山药多糖40、70、100mg/kg，二甲双胍100mg／kg灌胃给药4周，每天1次。灌胃结束后大鼠禁食过夜，测定空腹血糖；迅速切除肝组织和后腿肌肉组织，分别测定己糖 激酶和琥珀酸脱氢酶活性、苹果酸脱氢酶活性。   分别于实验前、实验第3、6、9、12周分别断尾取血，用血糖测定仪测定空腹血糖值。将所得数值进行统计学分析，最后得出山药多糖对大鼠的糖尿病的治疗是否有意义。 3 山药多糖的体外实验研究山药多糖的体外实验研究山药多糖的体外实验研究山药多糖的体外实验研究 3.1实验用细胞及培养方法 细胞实验利用ECV304（人脐静脉内皮细胞株）进行高糖对细胞的损伤作用及山药多糖拮抗高糖损伤作用实验研究。细胞培养应用RPMI1640培养基。细胞传代方法：细胞融合达到85-90%时，弃掉培养液，PBS冲洗2遍，吸取1.5 ml 0.25%胰酶至培养瓶中，室温消化2

min后弃掉胰酶，迅速添加3-4 ml含15%胎牛血清（FBS）的RPMI培养液终止消化，制成单细胞悬液。将含15%FBS的RPMI培养液加入细胞悬液中，按每个培养瓶加入10 ml计算补足培养体系，吹打均匀并接种于细胞培养瓶中。培养条件：在37℃，5%CO2的细胞培养箱中进行细胞培养。 3.2 山药多糖拮抗高糖损伤作用实验研究 （1）山药多糖对高糖诱导的细胞凋亡的影响 将ECV304细胞培养于含10%血清的RPMI 1640培养液中，将细胞随机分为四组，正常细胞组、高糖组（细胞培养体系中加入葡萄糖使其终浓度为35 mM）、甘露醇高渗对照组（加入甘露醇至终浓度25 mM）、山药多糖保护组（细胞培养体系中加入葡萄糖至终浓度35 mM,同时加入GBE至终浓度500μg），待细胞生长至70%-80%汇合时，将培养液中的血清浓度换为1%，培养24h后换至含10%血清的RPMI培养液。按照不同的分组向细胞培养体系中加入不同的处理因素，加入处理因素后继续培养24h，24h后收集细胞。细胞经PBS洗涤2次（1500 rpm，5 min）后，加入Annexin V孵育45 min后，用PBS洗涤细胞2次，用200μl PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行各组细胞凋亡情况测定。 （2）山药多糖对细胞内Ca2+浓度的影响 细胞分组及细胞处理同3.1。收集细胞后，用PBS洗涤2次，用PBS制成2×106  ·ml-1 单细胞悬液，取含有5×105个细胞的上述细胞悬液至1.5 ml离心管中，向离心管中加入Fluo-3/AM Ester使其终浓度至5μmol/L，混匀后，37℃孵箱中避光孵育45 min，用PBS洗涤细胞2次（1 500 rpm，5 min）；流式细胞仪检测荧光强度，检测条件为激发波长488 nm、发射波长530 nm。 （3）山药多糖对细胞线粒体膜电位的影响 细胞分组及细胞处理同3.1。收集细胞后，用PBS洗涤2次，用PBS制成2×106  ·ml-1 单细胞悬液，取含有5×105个细胞的上述细胞悬液至1.5 ml离心管中，向离心管中加入Rh 123使其终浓度达5 mg/L，混匀后置37℃孵箱中避光孵育45 min，PBS洗涤细胞2次（1 500 rpm，5 min）；用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，FCM检测条件为激发波长488 nm、发射波长530 nm。 （4）山药多糖对细胞影响的超微结构观察 用含15%FBS RPMI1640培养液培养ECV304细胞至融合度85-90%，将培养液换为含1.0%FBS的RPMI培养液同步细胞生长，继续培养24 h。更换培养液为含10%FBS的RPMI培养液，细胞分组及处理同3.1。24 h后，收获上述各组细胞，将细胞收集于0.5 ml离心管中（1 500 rpm，10 min），送电镜室制片、观察及照相。 （5）山药多糖对细胞产生氧自由基的影响 细胞的培养、分组及处理同3.1，每组3瓶细胞。收获各组细胞后将细胞悬液转移至离心管中，1 500 rpm离心5 min，弃上清，加入1 ml预冷的生理盐水，冰浴5 min，超声裂解细胞（强度以不产生泡沫为准），12 000 rpm离心10 min，上清液移至1.5 ml微量离心管中。按试剂盒说明书所示操作方法测定上清中SOD活力、MDA含量、超氧阴离子、羟自由基和总蛋白含量。 （6）山药多糖对细胞膜流动性的影响 细胞的培养、分组及处理同3.2.1，每组3瓶细胞。收获细胞时，弃掉细胞培养液，不经酶消化处理，直接用PBS液吹打细胞使其脱壁；收集细胞悬液，用PBS将每组细胞分别制备成2×106·ml-1细胞悬液。将5-SA应用液加入细胞中，终浓度为0.5 mmol/L。37℃水浴中保温孵育0.5 h，然后用PBS溶液反复洗涤细胞（1 500 rpm，5min），直至上清液中检测不出电子自旋共振信号。将标记好的细胞吸入毛细管中，测量其电子自旋共振波谱，检测条件：场强3366±100 G，振幅4×103，微波功率10 mW。

3.3统计分析 利用SPSS12.0统计软件进行统计分析，各组间测定指标比较用方差分析。