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三级学科 微生物学及检验 项目编号码_______________
项目——导师制实验报告
实验名称： 上呼吸道菌群分离培养、鉴定及药敏分析 学生姓名：_________史纯宾________华骏鹏 ______ 年 级： 10 医 检 2 班 专 业： 医学检验学 指导教师：
王健 教授 实验日期：
2012年10月26 日
安徽理工大学医学院 二○一二 年 十 月 一、实验概述 细菌属典型的原核细胞型微生物，无核膜、核仁，核呈环状裸DNA团块结构。其种类多、数量大、分布广，绝大多数对人类是有利的，有些还是人类所必需的，仅少数细菌可使人类致病或条件致病。
上呼吸道是多种菌群常居的部位，大多数细菌对人体有益，如四叠球菌、乳酸杆菌等，它们共同构成人体上呼吸道的正常菌群，具有拮抗其他病原菌生长的特点。
条件致病菌是指一部分细菌通常情况下对人体无害，但在一定条件下（如人体免疫功能低下、危重病人、慢性病患者、寄居部位改变、抗生素滥用致菌群失调时）能够引起感染，称为条件致病菌，如肺炎双球菌、肺炎克雷伯氏杆菌等。近年来，因条件致病菌所致的感染在临床感染中所占比率逐渐增加。
当发生上呼吸道感染时，从咽拭子、痰标本中可获检多种致病菌，如金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、结核杆菌等。部分久病或有基础疾病患者往往存在两种或两种以上混合感染，需要采用不同的培养基分别进行分离培养、生化鉴定。
由于上呼吸道是多种菌群常居的场所，如何快速、准确鉴定是一项比较困难的工作，需要借助一套系统的检测方法。标本直接涂片、染色、镜检可初步了解上呼吸道标本优势菌群的种类，具有廉价、操作简便、实验要求低等优点，但敏感性、特异性较低，可为下一步检测提供参考依据；细菌培养是鉴定细菌的金标准，具有特异性强的优点，但营养要求高、耗时长；生化反应是鉴定细菌种群、型别的重要依据，不同生化反应按一定规律编排、编码，可快速有效地将细菌鉴定到种及亚种；血清学反应是利用抗原抗体反应原理鉴定细菌型别的方法，具有灵敏性高、特异性强的优点，且耗时短，实验要求不高，一些重要致病菌通常需要借助血清学鉴定，如沙门氏菌、志贺氏菌等。分子生物学是近年来鉴定细菌的新方法，可检测微量病原体，较常规方法具有更高的灵敏性、特异性。
药敏试验指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原菌有无抑制作用，因其不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对较低，是一种既经济又有效的方法，可为临床合理应用抗生素，预防耐药菌株的出现，提供重要实验依据。
本实验以在校医学生上呼吸道标本为样品，探讨上呼吸道菌群的分离、培养、鉴定和药敏，了解在校医学生上呼吸道菌群分布特点及对常用抗生素的敏感性，为预防上呼吸道细菌感染和合理使用抗生素提供实验依据。 二、实验目的和意义 1、掌握上呼吸道标本的采集方法；
采集咽喉标本的正确方法：明亮的光线从检查者的肩膀上方照射进张开的口腔，让患者深呼吸，然后发“啊”音，用压舌板轻轻压舌，用拭子来回刮擦咽后部（注意不要接触到口腔和舌黏膜）。收集标本后，拭子放人无菌管中立即送检，尽量缩短标本采集与处理之间的时间，防止标本干燥。如不能在4h内处理标本，应将拭子放至运送培养基中送检。 2、掌握上呼吸道标本常见的正常菌群、条件致病菌和致病菌；
正常人的上呼吸道有许多常居菌寄生，主要有α溶血性链球菌、奈瑟菌属、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、嗜血杆菌、类白喉棒状杆菌以及大量的厌氧菌。在正常情况下，这些细菌是不致病的。但在机体全身或局部抵抗力减低或其他外因影响下，它们可以致病，并可以侵入下呼吸道引起感染。
血浆凝固酶试验
色素试验（结果有：金黄色、柠檬色、白色） 氧化酶试验 触酶试验 厌氧甘露醇发酵：接种细菌后加石蜡油少许封液——（37℃，18~24h）颜色变化判定结果。 菊糖发酵管：无菌接种环接种细菌入反应管——（37℃，18~24h）颜色变化判定结果。 胆汁发酵管：无菌接种环接种细菌入反应管——（37℃，18~24h）颜色变化判定结果。
4、掌握细菌的药敏试验；
测定细菌对抗菌药物的敏感度，简称药敏试验。它可以提示临床医生选用特效的药物治疗疾病，尽量避免细菌的耐药性产生以及估计用药的合适剂量。此外，在治疗过程中吸魂对药物的敏感性也会发生变化，随着各种抗生素的广泛使用，特别是不确定的滥用，细菌对药物的抗药性也在增多。因而，为了合理、有效的用药，事先做细菌对抗菌药物的敏感性试验很有必要。临床上测定细菌的药物敏感性试验方法主要有：纸片扩散法、试管稀释法。 三、实验应具备的物质条件 1、试剂：
KIA、MIU初步生化反应管；系统生化反应管；志贺氏菌属、沙门氏菌属多价及单价诊断血清；药敏纸片；Gram’s stain染色液（自制），氧化酶（自制）、触酶试剂（自制）。
琼脂粉（日本进口分装，批号：）；布氏肉汤粉（杭州微生物试剂有限公司，批号：20120527）；克氏双糖铁（KIA）琼脂（杭州微生物试剂有限公司，批号：20120622）；营养琼脂（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20120808）；血平板（自制）；SS琼脂（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20120708）；Macconkey琼脂（杭州微生物试剂有限公司，批号：20120928）；抗生素药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司，批号：）；细菌系统生化鉴定管（精氨酸脱羧酶：杭州微生物试剂有限公司，批号：20120822；）；杆菌肽鉴定纸片，Optochin鉴定纸片。 2、仪器：Olympus显微镜（日本Olympus公司），Nikon E-400荧光显微镜（日本Nikon公司）VS-800型超净工作台（苏州净化装备有限公司），37℃恒温培养箱，Microfuge 18型高速离心机（美国Beckman公司），5415D型速离心机（德国Eppendorf公司），电泳仪，电泳槽，移液器；BP-Ⅱ型架盘药物天平（上海医用激光仪器厂），YXQ SG41.280型便携式高压灭菌锅（上海华线医用核子仪器有限公司），电炉（1500w）。 3、其它：PH试纸，平皿，称量纸，量筒、三角烧瓶、烧杯、接种环，接种针，酒精灯，二甲苯，香柏油，擦镜纸，无齿镊子，玻片，记号笔，Eppendorf管（1.5ml、0.5ml），Tip头（20μl、200μl）、Tip头盒、铝制饭盒等。
四、注意事项 1、可疑菌落的鉴别：血平板上生长的大数为球菌且一般都有颜色。 2、生化反应的判断和分析： (1)．待检菌应是纯种培养物:纯培养物系指单一菌细胞繁殖的后代，因此待检菌必须是取自经过分离、纯化的培养物。否则，所观察的生化反应可能是两种或多种菌的混合反应，造成试验紊乱，无法得出正确的鉴定结果。 (2)．待检菌应是新鲜培养物:生化试验的待检菌，最好采用１８一２４小时的新鲜培养物，此时细菌群体细胞的生理特征比较一致。培养时间过长或陈旧的培养物，细胞衰退，生理特征亦会发生改变，常可影响鉴定结果的准确性。 （3)．严格遵守观察反应的时间:观察生化反应结果的时间，应根据试验项目的要求确定并严格遵守。生化试验观察结果的时间，多为２４小时或４８小时，这是根据一般实验情况确定的，时间过长或过短，不能观察到正确结果。观察试验反应结果，往往需加入试剂，加入试剂的时间也应根据各试验的具体要求，注意掌握。不适时地（反应物尚未出现或者消失）加入试剂，就不会得出正确的结果。但反应物出现的时间，常受到许多条件的影响（如培养基原料、制备方法、接种量等），加入试剂的时间很难强求一致，因而必须按照各试验的规定要求，适时加入。 （4)．应做必要的对照试验:培养基、试剂和试验方法等，可直接影响试验结果。故每批培养基配成后，均应以阳性及阴性菌株测试，符合要求时，方可用于正式试验。对一些反应不够稳定或影响因素甚多的试验，需在每次试验的同时，进行阳性和阴性菌株对照试验。 (5)．注意提高阳性检出率:为了提高检出率，至少应挑取２一３个待检的疑似菌落，分别进行试验。菌落挑取数愈多，阳性检出率愈高。
3、药敏试验分析：药敏实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。
五、实验设计原理 1、 上呼吸道标本直接涂片、镜检初步确定优势菌群大类；
细菌是胶体性物质，检查时必须将它们固定在玻片上，经过轻烤脱水即容易使菌体黏贴在玻片上，就算经过随后的染色、水洗等步骤也不易脱落。染色前必须将细菌固定，目的是杀死细菌，并使它黏贴于玻片上，常用加热法，固定时应尽量使细菌维持原有形态，防止变形。 2、 采用分离划线法分离培养可疑菌落；
细菌在自然界分布广泛，种类极多，被检材料常含有多种细菌。若欲专门研究其中一种细菌，或须证明该材料是否有某种细菌时，必须进行细菌分离培养，获得纯种培养物后才能进行研究。此外，在实验室内保存的菌种，如不慎被其他微生物污染后，亦需重新制备，保存菌种。 3、 可疑菌落直接涂片、镜检初步确定类别，并与培养前镜检结果比较； 4、 采用初步生化反应和系统生化反应鉴定病原性球菌 咽喉标本
血平板分离培养37℃ 18~24h 革兰染色镜检
5、 以K-B法检测细菌的药物敏感性；
由Bauer和Kirby所建立的纸片琼脂扩散法，简称K-B纸片法。其原理是将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含有的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反应测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC值越小。纸片扩散法简单方便，且可在临床标本分离培养出细菌的同时使用。
六、实验方法、步骤 1、培养基（固体）的制备 ①小心称取营养琼脂粉22.5g，置一洁净500ml三角烧瓶，加入500ml蒸馏水，在电炉上加 热，以玻璃棒搅拌，使其充分混匀完全溶解。 ②盖好烧瓶盖并包扎好，置高压灭菌锅内121℃15min。 ③冷却至50℃后加入10% 无菌脱纤维羊，血充分混匀， ④趁热分装无菌平皿，每个平皿约15ml，盖好皿盖，置室温中自然冷却。 ⑤将含培养基的平皿倒置，取出后置4℃冰箱中备用。 2、以无菌棉拭子取晨起新鲜上呼吸道标本；
3、以4区划线法分别接种于血平板,37℃温箱孵育18~24h；
4、以完成分区划线的棉拭子Gram’s stain染色镜检，观察记录优势菌群的形态特征和染色特点；
5、分别取正常菌落和可疑菌落行系统生化反应； （2）、可疑菌落的识别；
（2）、可疑菌落革兰染色，镜检； （3）、可疑菌落生化反应 6、分别取正常菌落和可疑菌落行单纯药敏试验； 七、实验路线及方法变更 八、实验内容与预期目标 一）实验内容 1、上呼吸道细菌标本的分离培养； 2、可疑菌落的Gram’s、Hiss染色，镜检； 3、可疑菌落的生化反应，包括初步生化反应和系统生化反应； 4、细菌的K-B法药敏试验； 二）预期目标 1、掌握上呼吸道标本细菌分离培养方法和步骤 2、掌握上呼吸道标本细菌的鉴定方法、鉴定要点和步骤 3、掌握K-B法细菌药敏试验 九、结果 1.上呼吸道标本直接涂片镜下菌群特点（见图1） （1）革兰染色阳性双球菌，菌体矛头状，宽端相对，尖端向外，具有厚的荚膜，无鞭毛，无芽胞，提示肺炎双球菌； (2)革兰染色阳性，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝，形似酵母菌的个体，提示白色念珠菌； 2.上呼吸道标本在血平板上的生长特点 (1)细小、灰白、透明或半透明有光泽的扁平菌落（见图2），周围有狭窄草绿色溶血环，提示肺炎双球菌和甲型链球菌。 (2)菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径0.5~1.0μm，菌落周围形成透明溶血环（见图3），提示金色葡萄球菌和乙型链球菌。 (3)其他可能菌：表皮、四叠球菌、大肠杆菌、齿垢杆菌、白色念珠菌。 3.病原性球菌的初步生化反应(结果见于图4 ~ 图7) (1)氧化酶试验:阳性(结果1);阴性(结果2) 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。 (2)触酶实验:阳性 原理：触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。 4.病原性球菌的主要鉴定实验(结果见于图8,图9) (1)厌氧甘露醇发酵:阳性
(2)菊糖发酵:阳性 (结果1);阴性(结果2) 用途：适用于微球菌科和非发酵菌的鉴定
(3)胆汁溶菌:阳性 原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，可能是由于胆汁降低细胞膜表面的张力，使细胞膜破损或使菌体裂解；或者是由于胆汁加速了肺炎链球菌本身自溶过程，促使细菌发生自溶。 6.细菌的K-B法药敏试验(结果见于图10;图11) 原理：纸片扩散法：该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。 溶菌圈直径大小比较:青霉素(8mm) <头孢(19mm)<红霉素(21mm)<氯霉素(22mm)<庆大霉素(24mm) 实验图片
十、讨论 上呼吸道是多种菌群聚集的场所，包括正常菌群、条件致病菌等，其种类多、数量大，大多数细菌对人体有益，可拮抗致病菌生长。常见正常菌群如四叠球菌、八叠球菌。条件致病菌如葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌。常见致病菌有金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、肺炎双球菌、脑膜炎双球菌等。 以往，上呼吸道标本细菌的检测通常采用形态学检查，虽然方法简便、易于操作，但上呼吸道菌群繁杂，形态上十分相似，仅凭显微镜观察不易区别。本实验采用咽拭子标本直接涂片、染色、镜检，见少量G+球菌，散在或成堆排列，亦有呈双排列，部分细菌周围见明显荚膜，未见芽孢，未见其他形态细菌，提示G+球菌为优势菌群。 1.血平板观察菌落形态、涂片镜检： 咽拭子标本在血平板上分离划线、常规培养24h后，分离出二类菌落，一部分细菌菌落细小、灰白、透明或半透明，周围有狭窄草绿色溶血环；另一部分细菌菌落圆形凸起，直径0.5~1.0μm，周围有透明溶血环，有的溶血环相互融合成片，提示该咽拭子标本至少还有2种细菌。 取血平板上可疑菌落常规涂片、革兰氏染色、镜检，见大量G+双球菌，菌体周围有较宽的不易着色的荚膜。见大量G+中等大小球菌，散在或成堆排列，未见荚膜和芽孢，提示咽拭子标本中可能含有肺炎双球菌和葡萄球菌。 2.生化反应是鉴定病原性球菌的重要依据，常用生化反应有氧化酶试验、触酶试验等。 (1)氧化酶试验：原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。以滤纸条折角沾取血平板是可疑菌落，观察见金黄色，然后滴加氧化酶试剂，含菌培养物处未见紫红色，提示氧化酶试验阴性。 (2)触酶试验：原理：触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。取血平板是可疑菌落置一洁净玻片，小心滴加新鲜配制的3%H2O2，见细菌培养物周围出现大量气泡，提示触酶试验阳性。 (3)厌氧甘露醇发酵试验：取血平板是可疑菌落置一甘露醇发酵管，然后加入少量石蜡油覆盖，常规培养24h后，见甘露醇发酵管由紫色转变为黄色，提示厌氧甘露醇发酵试验阳性。 (4)菊糖发酵试验：取血平板是可疑菌落置一菊糖发酵管内，常规培养24h后，见菊糖发酵管由绿色转变为黄色，提示菊糖发酵试验阳性。 (5)胆汁溶菌试验：胆汁溶菌试验原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，可能是由于胆汁降低细胞膜表面的张力，使细胞膜破损或使菌体裂解；或者是由于胆汁加速了肺炎链球菌本身自溶过程，促使细菌发生自溶。取血平板是可疑菌落置一胆汁微量发酵管，常规培养24h后，未见浑浊现象，提示胆汁溶菌试验阳性。 3.细菌药敏试验 细菌药敏试验不仅可了解某些药物体外对某种细菌的敏感性，而且可为临床选用合理、有效抗生素提供实验依据。因其操作相对简单，成本相对降低，是一种既经济又有效的方法，已在临床广泛使用，最常用的方法为K-B法药敏试验。 本实验结果显示，庆大霉素对金葡菌产生的抑菌圈最大，达24mm，而青霉素产生的抑菌圈最小，为8mm，提示庆大霉素在体外对金葡菌的抑杀效果较明显，其抑杀机制可能与干扰细菌核蛋白体的合成功能有关，当出现因金葡菌所致的皮肤或其他部位感染，可优先选用庆大霉素。而青霉素对金葡菌的抑杀作用较弱，其可能的机制与金葡菌产生β-内酰胺酶、钝化酶有关，当出现因金葡菌所致的皮肤或其他部位感染，不宜选用青霉素作为首选药物，此与目前大多数学者报道结果一致。 十一、结论 1、上呼吸道是多种菌群群居的场所，以G+菌较常见，如葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌等。 2、生化反应在上呼吸道菌群鉴定中有重要意义；其中病原性球菌借助一般的生化反应即可确定菌种。 3、上呼吸道标本细菌分离培养、鉴定，可较准确了解在校大学生咽部或痰中菌群分布特点，了解正常菌群、条件致病菌的构成。 4、药敏试验可准确筛选出耐药菌株，为临床合理应用抗生素提供可靠实验依据。 参考文献 [1] Zschock M, Nesseler A, Sudarwanto I. Evaluation of six commercial identification kits for the identification of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis. J Appl Microbiol. 2005;98(2):450-455 [2] 李春梅. 肺炎链球菌肺炎的临床诊断与治疗. 中外健康文摘,
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