1998 年諾貝爾醫學獎研究主題一氧化氮 (NO, nitric oxide) 是個具有像雙魚座兩條魚游向不同方向特質的矛盾分子，他的表兄弟可能比他有名，像笑氣(N2O) 和硝化甘油。
L-精胺酸(L-Arginine)是一種珍貴的胺基酸補充劑，雖然精胺酸並非必須胺基酸(人體不能自行合成的胺基酸稱之為必需胺基酸)，但是精胺酸對於人體健康卻有特別的意義，精胺酸是人體一氧化氮的來源，一氧化氮傳導信息的功能隨製造其出來的地方而不同。主要有三種功能：
(1) 在血管內皮是使血管的平滑肌細胞放鬆而擴張血管，而可以降低高血壓，當這作用在陰莖海綿體則可促進陰莖勃起。(2) 在神經突觸則是當作神經傳導因子，和腦部學習及記憶有關。(3) 在巨噬細胞則可損壞腫瘤細胞而將其殺死或停止其繁殖。
精胺酸除了可作為蛋白質合成之用，還可作為內在性血管擴張劑的前區物質，而這種表皮內壁生成素擴張因子(EDRF)確實被人發現，存在於血管管壁上。
目前科學家已證實表皮內壁生成素擴張因子(EDRF)在化學結構上屬於一氧化氮，它是一種自由基的氣體，以往被認為存在於巨噬細胞，它被認為可調和數個細胞的毒性作用。科學家已經證實一氧化氮就是等於表皮內壁生成素(EDRF)，這個內在的物質在人體內廣泛性的生理過程中，的確扮演了關鍵性的角色。
圖一：L-精胺酸 (L-arginine) 在一氧化氮合成酉每的催化下轉換成 L-西瓜胺酸 (L-citrulline) 和一氧化氮 (NO)
1998 年諾貝爾生理醫學獎 -- 具雙魚座特質的一氧化氮
黃頂立 DEENG-LIH HUANG, Ph.D.
美國哥倫比亞大學生物有機化學博士
E-mail: dh459@
(電腦字數統計：中文字 1,263，英數字 58)
1998 年諾貝爾醫學獎研究主題一氧化氮 (NO, nitric oxide) 是個具有像雙魚座兩條魚游向不同方向特質的矛盾分子。1980 年前一氧化氮還是個惡名昭彰、會破壞大氣層、製造酸雨的環境污染毒物和致癌嫌犯，喜歡在不友善的地方顯相，如車子的廢氣和香煙的煙。自 1986 年世界許多研究人員競相和這第一個在生物體內扮演傳導信息的氣體分子談戀愛後，發現輕薄短小、無任何色香味的一氧化氮在心血管循環系統、神經系統、免疫系統、抗癌物、呼吸系統、消化系統……等許多領域有奧妙重要的有益也有害的功能。
一氧化氮 (NO) 是含一未配對電子的自由基，十分活躍不安定，生命週期很短，只活約十秒就會氧化成亞硝酸鹽 (nitrite, NO2－) 和硝酸鹽 (nitrate, NO3－)。一氧化氮有一個令人開懷大笑又有點香香甜甜的表弟叫氧化亞氮 (nitrous oxide, N2O)，也就是俗稱的笑氣，是用來當作全身麻醉劑。
雖然微生物可由亞硝酸鹽還原或氨氧化製造一氧化氮，哺乳動物則較複雜，要由 L-精胺酸 (L-arginine) 在一氧化氮合成酉每的催化下經過一中間產物轉換成 L-西瓜胺酸 (L-citrulline) 和一氧化氮 (NO) (圖一)。
圖一：L-精胺酸 (L-arginine) 在一氧化氮合成酉每的催化下轉換成 L-西瓜胺酸 (L-citrulline) 和一氧化氮 (NO)
一氧化氮傳導信息的功能隨製造其出來的地方而不同。主要有三種功能：(1) 在血管內皮是使血管的平滑肌細胞放鬆而擴張血管，而可以降低高血壓，當這作用在陰莖海綿體則可促進陰莖勃起。(2) 在神經突觸則是當作神經傳導因子，和腦部學習及記憶有關。(3) 在巨噬細胞則可損壞腫瘤細胞而將其殺死或停止其繁殖。這三種功能的作用機制是不同的多步接力，且用於催化一氧化氮製造的一氧化氮合成酉每也不同。一氧化氮合成酉每有組成式和感應式二種，是鈣和調鈣蛋白依賴的，主要有四組成群 (原血紅素 heme、FAD、FMN、H4B)。
一氧化氮傳導信息無局限特定的管道或傳輸物，可在任何製造其出來的地方快速滲透到任何方向，使得控制其製造量是調節其活性的關鍵。
要減少一氧化氮製造量可用一氧化氮合成酉每抑制劑，如長得像 L-精胺酸的 NG-單甲基-L-精胺酸 (NMLA, NG-monomethyl-L-arginine，圖二)。細菌感染可導致敗血病性休克(septic shock)，這病在美國是加護病房的主要死因之一，其病因是白血球釋放大量的一氧化氮來消滅細菌，而大量的一氧化氮使血管擴張造成血壓下降，這時可用一氧化氮合成酉每抑制劑 NMLA 來治療。
圖二：一氧化氮合成酉每抑制劑 NG-單甲基-L-精胺酸 (NMLA, NG-monomethyl-L-arginine)
一氧化氮(NO)能促使血管舒張，促進血液循環,醫學臨床研究強烈支持，精胺酸補充劑有效的降低心肌梗塞的發生率，同時具有舒張血管,降血壓，促進血液循環順暢的作用，對於心血管疾病的預防及動脈硬化患者，心肌梗塞的發生率具有明顯的降低作用。人們早就知道可以用製造炸藥的硝化甘油來治療心肌梗塞。但是據說諾貝爾晚年拒絕用硝化甘油來治療他的疾病，他認為這是個諷刺.
精胺酸也具有抗氧化作用，可以降低低密度脂蛋白(LDL)氧化，形成血管內層乳糜沉殿的作用,因此對於心臟小血管阻塞，造成心肌壞死的機率下降，同時臨床證實，早晚補充1000毫克(1公克)的精胺酸，可以有效降低心絞痛的發生率。
精胺酸同時被多項醫學臨床研究證實，具有改善性功能障礙，及有效提高精子數量及活動力的臨床作用，每天服用4-5公克的精胺酸，持續半年的研究發現，約有20~35%的夫妻可以懷孕。
精胺酸可有效提高免疫力，促進免疫系統分泌自然殺手細胞，吞噬細胞，白血球內烯素(interleukin-1)等內生性物質，有利於對抗癌細胞及預防病毒感染，另外，精胺酸是鳥氨酸(L-ornithine)及脯氨酸(L-proline)的前驅物。
精胺酸(L-arginine)可以應用在臨床上幾種情況，
第一，心血管疾病尤其是心絞痛，第二，糖尿病合併腎動脈硬化症，第三，精蟲減少引發不孕症，第四，男性性功能障礙者。
近年來精胺酸(L-arginine)加上抗氧化劑，所組合而成的營養食品逐漸上市，高藥師最近讀到一篇用碧蘿芷和左旋精胺酸(L-arginine)的2003年的報告。
Treatment of Erectile Dysfunction with Pycnogenol and L-Arginine. Journal of sex & Marital Therapy,29(3):207-213,2003
這個實驗主要是將受試者分成三組，第一組是25~45歲，有勃起困難的時間約5.3年，首先第一個月先讓他們單純吃三公克的左旋精胺酸只有5%的受試者得到改善：但是如果第二個月除了三公克的左旋精胺酸以外，另外再加上80豪克的碧蘿芷，居然就有80%的改善;如果第三個月除了三公克的左旋精胺酸以外另外再加上120豪克的碧蘿芷，居然有95%的人有改善!!
第二組的病人大於45歲，提供她們吃複方的碧蘿芷加上左旋精胺酸一年，有80%的老人恢復性功能，而且整個實驗無副作用，一年的期間可以改善精液，而且讓42%的配偶懷孕。
第三組的病人是30到60歲，針對37位中度勃起功能障礙的病患，給予六周的碧蘿芷加上左旋精胺酸的成分。六週後81%判斷有效。70%的受試者認為可以增加陰莖硬度，73%的男性報告更容易勃起，65%報告增加早上勃起力。
結論：可是在台灣的產品中，並沒有發現有上述產品可以達到實驗所描述的效果，我想實驗歸實驗，還是不要被廠商迷惑吧，如果真要買，建議一天服用價格不要超過20元，才是合理價格。
目錄~
摘要 2
前言 2
得獎者介紹 2
三位得獎者的實驗歷程及相關機制之發展 3
Dr. Furchgott的實驗及假說 3
Ferid Murad的貢獻 5
NO在血管內皮的機制 6
名詞簡介 7
平滑肌磷酸化後收縮機制 9
證明EDRF即為NO 10
NO在神經方面的作用 12
突觸間nNOS產生NO的路徑 12
NMDA receptor 14
NO在免疫方面的作用 15
一氧化氮與巨噬細胞 15
自由基毒殺路徑 15
NO直接毒殺路徑 16
NOS的種類 17
NO的應用--威而剛(Viagra) 18
總整總圖 19
參考資料 19
摘要
Nitric Oxid（NO）是一種生物體中的氣體訊息傳遞物質。由某一細胞分泌出NO，接著NO穿透過另一細胞之細胞膜並調控了此細胞之細胞功能是生物學上訊息傳導的一項新發現。NO訊息分子的發現獲頒了1998年的諾貝爾生理醫學獎。
前言
一氧化氮（Nitric Oxide,NO）是地球上最簡單的分子之一，過去一直被認為是種有害的氣體（事實上，在某些方面是），可能破壞大氣層、造成酸雨及致癌。然而在１９８０年代之後，研究人員漸漸發現一氧化氮在心血管循環系統、神經系統、免疫系統……等許多領域也有不少奧妙重要的功能。
關於一氧化氮的研究很多，到底１９９８年三位得獎者得獎的關鍵是什麼呢？一氧化氮的重要性在於其被發現可作為生物體內的信息傳遞分子，它可由特定細胞製造並輕易地穿過細胞膜到達鄰近細胞，進一步調控鄰近細胞的生理功能。與其他訊息傳遞分子不同的是，它是第一個被發現具有此功能的氣體，被諾貝爾新聞稿稱為＂an entirely new principle for signaling in biological systems＂；此外，一氧化氮的半衰期極短，大約只有十秒左右，之後就會氧化變成硝酸鹽或亞硝酸鹽，恰巧在完成訊息傳遞之後自己達成分解的功能。正由於以上令人驚豔的特質，三位在此領域投注心力的學者得以榮獲９８年的諾貝爾獎。
得獎者介紹
Dr. Robert F. Furchgott
於1916年7月4日誕生於美國South Carolina的Charleston。他的研究工作是在紐約布魯克林的SUNY Health Science Center的藥理學部門裡進行，主要研究為藥物造成的血管內皮細胞收縮及擴張。在某次實驗中，他意外地發現原本認為只能擴張血管的乙醯膽鹼 (Acetylcholine) 竟然還可收縮血管。這件事讓他感到疑惑，為什麼相同的藥物有時候造成血管收縮，有時候卻造成血管舒張呢？Dr. Furchgott發現：產生兩種不同反應的血管其實是不同形狀的（一種是肌條狀，一種是環狀），他便大膽地推測：血管的「內皮細胞完整或損傷」的決定了「血管壁收縮或擴張」的結果（可能是某種剝離血管的方式傷害到內皮細胞）。並於1980年以實驗成功地呈現：乙醯膽鹼只有在內皮細胞完整時才會擴張血管壁，並發表在Nature期刊上。他認為血管壁之擴張是因為完整的內皮細胞製造出一種未知的訊息傳導物質而造成血管平滑肌肉放鬆之故。他命名這種訊息傳遞物質為EDRF（endothelium-derived relaxing factor，內皮衍生之舒張因子），他的發現進一步引領大家對此訊息傳遞分子的研究。
Dr. Ferid Murad
於1936年9月4日誕生於印地安內州的Whiting。他的研究工作在德州大學的基礎醫學研究部門（Department of integrative Biology，Pharmacology and Phsiology）進行。Dr. Murad本人是臨床醫師又是藥理學研究者，他分析硝化甘油與相關之血管擴張藥物是透過何種機轉去發揮效果，並於1977年發現：硝化甘油是經由釋放NO而使得血管平滑肌放鬆的，發表在 1977 年環核甘酸研究期刊上。這個結果令人困惑，一種特殊的氣體NO竟然可以調控重要的細胞功能。而且，包括乙醯膽鹼等的內生性因子，也經由NO去發揮作用。他的研究闡明了一氧化氮在血管擴張及訊息傳遞方面的角色。
Dr. Louis J. Ignarro
於1941年5月31日誕生於美國紐約布魯克林。在UCLE School of Medicine的分子及藥理研究部門裡進行基礎醫學研究。竭力探索EDRF的生化結構，於1986年證明「EDFR就是NO」，呼應了Dr. Furchgott和Dr. Murad的研究於。與Dr. Furchgott同時在1986年7月在美國明尼蘇達州羅徹斯特的一個心血管研討會上提出這不明的「內皮衍生放鬆因子」(EDRF) 是一氧化氮。這是人類首次發現一個氣體在生物體內可扮演一個訊息傳導因子的角色。其研究後來發表在1987年12月的美國國家科學院學報 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA)。
三位得獎者的實驗歷程及相關機制之發展
Dr. Furchgott的實驗及假說
Dr. Furchgott一直在研究調控血管的收縮與放鬆的藥物。在一九七○年代，他使用離體的動脈來研究乙醯膽鹼（acetylcholine）對動脈平滑肌的作用，但是經常得到不一致的結果。因為當時科學界已有普遍的認知，認為乙醯膽鹼會導致血管放鬆；但是在他的離體血管實驗中，乙醯膽鹼有些時候會造成血管平滑肌放鬆，但大部分時候卻造成血管肌肉收縮。經過詳細追蹤實驗過程，Dr. Furchgott發現在血管肌肉會放鬆的實驗中，研究助理並沒有把分離出來的血管「清理乾淨」，亦即血管最內層的一層薄薄的內皮（endothelium）細胞被「不小心」地保留了。於是他大膽地假設血管內皮細胞受乙醯膽鹼刺激後曾分泌一種物質，而這種物質會導致血管肌肉鬆弛。
他設計了一個簡單但極具巧思的實驗，亦即比較內皮完整的血管以及內皮被膠原蛋白酶（collagenase）去除掉的血管，分別被乙醯膽鹼刺激後的反應。他這篇只有兩個圖的論文發表在1980年11月的《自然》（Nature）科學雜誌上，並將這個血管內皮細胞所分泌的不明物質稱為「內皮衍生之舒張因子」（EDRF）。
以下即為Dr. Furchgott所做的實驗
Dr. Furchgott以兩組不同的動脈血管做實驗：一組維持原本的內皮細胞層（如上圖右）；一組將內皮細胞層移除（如上圖左）。他將兩種血管放在一起以乙醯膽鹼淋洗，再分開觀察（怕內皮分泌的分子影響到對照組）。實驗結果顯示，僅有含內皮層細胞的血管會有放鬆的現象。
上圖為Dr. Furchgott的實驗數據。上方的是血管環，下方則是肌條。左方為未刮除內皮的血管，右方則是刮除內皮的血管。分析本圖型大致可分為三個階段。首先，Dr. Furchgott將血管浸到充滿正腎上腺素（NE）的燒杯中，故四個圖形皆可看到肌肉由basal tention開始收縮（可見於上方四個圖）。第二階段為加入Ach後。左邊unrubbed的部分，無論是血管環還是肌條，都有放鬆的表現。而右邊rubbed則均持續收縮。這個部份乃左圖與右圖最大的不同。值得注意的是：左邊收縮曲現的下降方式是呈肌梯狀下降的。其原因為：單位量的Ach可與單位量的受器結合，引起一定程度的收縮。逐次加入Ach，即會造成圖形成階梯狀下降。第三個階段為淋洗（W）—將NE洗去，則血管又恢復basal tention（可見於四個圖）。本圖證明，並非血管的形狀影響了Ach的功用，“有無內皮”才是ACh決定肌肉收縮或舒張的主因。
Ferid Murad的貢獻
Dr. Murad發現在各種組織中均可測得cGMP，因此推測cGMP可能為一種二級訊息傳遞物（second messengers）。又由於cGMP是由GTP轉化而來，而在此反應中扮演關鍵角色的是一種叫鳥嘌呤核甘酸環化酶（guanylate cyclase／GC）的酵素，因此在70年代初期他的研究著重於其特性的探討。由於GC可將GTP轉化成cGMP，因此他便順理成章地推測任何可以活化GC的酵素皆可調控細胞內cGMP含量，進而影響細胞功能。然而在分離這酵素的過程中，發覺這些酵素不僅存在於細胞膜上，也存在於細胞質中。分布不同之酵素亞型，化學反應動力也不相同。於細胞膜上的酵素是藉著刺激物與受器結合以後而活化但是細胞質中的酵素是如何受到何種物質刺激而活化呢? 經測試後發現三氮化物(azide)、硝基氰酸鹽(nitroprusside)、硝化甘油等含硝基之化合物均可使細胞漿中的GC活化，而這些化學藥品於自發性化學反應下均可產生NO。之後他又做了一個實驗（如下圖），他準備了一個實驗組和一個對照組，兩組皆是含有GC的組織，而實驗組多添加了NO，結果發現實驗組的cGMP大量增增加，從此確定NO是活化GC主要物質。
上頁A圖是取自老鼠肺的萃取液，Ｂ圖則是牛的氣管平滑肌的萃取液。將NO通入兩種萃取液（含有GC）後，明顯的可以發現通有NO的cGMP的量有大幅上升，由此可以推斷GC有被活化。
又當時已知硝化甘油可使血管擴張，如此，由NO所活化而產生的cGMP如何影響肌肉舒張？已知肌凝蛋白輕鏈（myosin light chain）之去磷酸化會導致平滑肌舒張，因此他們進步一觀察cGMP是否會產生myosin light chain去磷酸化。經實驗証實：經NO活化平滑肌的GC進而產生的cGMP會使肌凝蛋白輕鏈去磷酸化，產生血管平滑肌舒張。
(1) 血管內的乙醯膽鹼和乙醯膽鹼受體結合，因而打開一個管道讓鈣離子進入血管內皮細胞內。
(2) 進入血管內皮細胞的鈣離子需要和調鈣蛋白1先組合形成調鈣蛋白2。
(3) 然後調鈣蛋白2再和內皮性一氧化氮合成酶(eNOS)7組合形成活化的內皮性一氧化氮合成酶(eNOS)8。
(4) 活化的內皮性一氧化氮合成酶(eNOS)8催化左旋精胺酸(L-arginine)，製造出左旋西瓜胺酸(L-citrulline)和NO。
(5) 血管內皮細胞的NO滲透入血管平滑肌細胞。
(6) 滲透入的NO和GC5的輔因子原血紅素(heme)的鐵離子結合，形成活化的GC6。
(7) GC6催化GTP(guanosine triphosphate，鳥嘌呤核甘三磷酸鹽)製造出cGMP(cyclic guanosine monophosphate 環鳥嘌呤核甘單磷酸鹽)。
(8) cGMP使控制平滑肌細胞收縮的鈣離子濃度下降。
(9) 控制收縮的鈣離子濃度下降導致平滑肌放鬆，因而擴張血管降低血壓。
(10)一氧化氮 (NO) 也可滲透回去血管內，而降低血小板間的聚集及降低血小板附著於內皮細胞。
附註：1. 在cGMP產生之後可能走的路徑有三條（如下圖），一條是藉著PDE（phosphodiesterase，磷酸二酯酶）的催化使cGMP水解回GMP；cGMP亦可使PKG（protein kinase G，蛋白激酶）活化，進而造成一連串磷酸化，使得平滑肌內的鈣離子濃度下降；也可直接使得平滑肌上的cGMP-gated ion channel關閉，造成平滑肌內的鈣離子濃度下降。
2. NO進入滲透回血管內後，會活化血小板內的GC使得鈣離子濃度下降。而血小板的凝集需要鈣離子的協助，因此，會間接造成血小板凝集效果降低。
名詞簡介
鳥糞嘌呤核苷酸環化酶（GC），分為兩種：
１．Soluble guanylyl cyclase（sGC）
sGC是由α與β兩個次單位所結合成的異型雙體（heterodimer），而兩個次單位又個別擁有為α1、α2與β1、β2兩種isoform。sGC的每個次單位的結構含有三個功能區：
(1)regulatory domain，在兩個次單位的regulatory domain中夾著一個血紅素-亞鐵離子（heme-Fe2+），NO會接在亞鐵離子上而使sGC活化
(2)central domain，是兩個次單位結合成異型雙體之處
(3)catalytic domain，需要Mn2+與Mg2+等輔因子(cofactor)的協助，催化GTP轉變成cGMP的反應；所以sGC被認為是NO的受體(receptor)，並且在各種組織中會增加cGMP的量。
（From：International Journal of Impotence Research. 16: pp. 459-469, 2004.）
Particulate guanylyl cyclases（pGC）
位於平滑肌細胞膜上的一種GC，可以將GTP轉變為cGMP。但活化pGC的刺激物不是NO，而是natrient peptides（簡稱NPs）。
磷酸二酯酶（phosphodiesterase，簡稱PDE）
PDE可分成class I、II、III，哺乳動物細胞內的PDE屬於class I，在C端含有HD（histidine/aspartate） domain，對cAMP和cGMP有高親和力，功能是催化cAMP或cGMP的3’cyclic phosphate bond的水解反應。
蛋白激酶G(protein kinase G，簡稱PKG)
PKG屬於serine/threonine kinase family，哺乳動物的細胞中含有兩種基因，prkg1和prkg2，分別編碼出PKG-I和PKG-II，而PKG-I的N端由兩個不同的外顯子（exon）編碼，分為PKG-Iα和PKG-Iβ兩種亞型。PKG主要分佈在平滑肌、血小板、小腦、海馬迴、背根神經節、神經肌肉終板以及腎臟，亦有少量分佈於心肌、血管內皮、顆粒球、軟骨細胞、蝕骨細胞。主要調節血管張力的PKG是PKG-I。
在血管平滑肌張力的調控上，PKG-I有三種作用方式：
(1) PKG-Iβ會磷酸化IP3 receptor-associated PKG-I subatrate(IRAG)，抑制肌漿網上IP3受器，使鈣離子無法從肌漿網釋放到細胞質。
(2)PKG-I直接磷酸化鈣離子依賴性鉀離子通道(Ca2+-dependent K+ channel：BKCa)，將鉀離子送出細胞外而形成膜電位過極化，減少鈣離子進入平滑肌細胞。
(3) PKG-Iα磷酸化肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase：MLCP)的Ser-695，使得Rho kinase無法磷酸化MLCP的Thr-696並抑制MLCP，使MLCP能將肌球蛋白輕鏈的磷酸根去除，造成平滑肌放鬆的結果。
平滑肌磷酸化後收縮機制
證明EDRF即為NO
在Dr. Furchgott提出EDRF後，Dr. Ignarro也投入了這項研究。
在當時的認知裡，EDRF是由血管內皮所產生，而且是在一連串機制裡的中間物質。NO則是從血管舒張劑，由含氮化合物如硝化甘油所產生的。而兩者的相同之處，就是半生期都非常短暫，只能存在3~5秒。所以EDRF難以分離出來，做更進一步的詳細研究。
而這樣不穩定的特性，讓Ignarro開始猜測EDRF的身分。在生物體內不穩定的性質，意味著它可能活性很強，可以和其他物質反應；或是帶有毒性的，以致於一但產生，就被分解。
在GC被活化的機制裡，NO結合在GC的βsubunit中心部位Heme的亞鐵原子上，使GC上的Histine 脫離GC，GC因而形變而活化，進行後續反應。
（如下圖）
Heme是什麼呢？
Heme是紅血球中，血紅素Hemoglobin的中心結構（如圖10）。Hemoglobin是由Heme和外圍的多肽鏈Globin結合所成。Globin所影響的，是Hemoglobin和氧氣結合的親和力。而和氧氣結合的關鍵，其實是Heme中央的亞鐵原子。
接下來，Ignarro收集了Ach刺激後的細胞培養液，加入各種的氧化劑、還原劑，來檢測培養液中，EDRF究竟擁有什麼樣的特性，來猜測可能是何種活性物質。
首先是02-，超氧根陰離子，會代謝掉EDRF，使它無法活化GC。再來是Superoxide dismutase (SOD)超氧化物歧化酶，這種酵素存在於生物體內，專門代謝自由基，使之無法破壞身體正常機能。而這樣的酵素一加入，就使得EDRF在培養液中穩定，能存在稍長時間。
接下來又加入了亞甲藍，這種藥劑會抑制NOS(一氧化氮生成酶)的作用，使NO無法產生；另外一種則是氧合血紅素，雖然NO會合血紅素結合，但是它卻不像CO、CN-具有強勢的結合力，所以在氧氣結合之後，便無法和血紅素結合。以上的兩種藥劑，使得NO無法產生、穩定存在，而影響了GC的活化以及後面血管內壁的舒張反應，而在此實驗中，此兩藥劑亦達到同樣效果，因此Ignarro便開始猜測EDRF是NO的可能性。
Dr. Ignarro選擇上面所提的Hemoglobin，讓NO結合來延長半衰期，並且使EDRF也進行相同反應，進行頻譜分析來檢定。他將Hemoglobin加入含内皮細胞的試管裏，然後使内皮細胞受到刺激並釋放出EDRF。現在試管裏有兩種物質：hemoglobin和EDRF。然後，Dr. Ignarro使光線從試管裏穿過去，由detector偵測波長。我們都知道每一種物質都有它特定的吸收波長，所以當光線穿過試管時，部分的波長被試管裏的hemoglobin 和EDRF吸收，讓detector偵測不到。因此，我們可以從detector偵測到的波長反推回去，便可以知道hemoglobin和EDRF的吸收波長分別是425nm和400nm。同樣道理，他將hemoglobin和NO混合在試管裏，所得到的結果就一樣的。Hemoglobin和NO的吸收波長分別是425nm和400nm。從這個實驗的結果，Dr. Ignarro證明了EDRF就是NO。
上圖黃線為hemoglobin的譜線，綠色是和EDRF結合後的曲線。
下圖黃線同樣是hemoglobin，可是和NO結合後的譜線，完全一樣，因此證實兩者為同一物質。
NO在神經方面的作用
突觸間nNOS產生NO的路徑
(1) 左邊的前突觸神經元釋放的化學信息物麩胺酸鹽（glutamate）和後突觸神經元的N-methyl-D-aspartic acid（NMDA，N-甲基-D-天門冬胺酸鹽）receptor結合，因而打開一個管道讓鈣離子進入細胞內。
※此圖省略一些重要的步驟，glutamate並不會這麼容易就和NMDA receptor結合，還需要非NMDA receptor（亦即AMPA receptor）的參與：
依據NMDA活化的能力，可將麩胺酸（glutamate）的受器分成NMDA與非NMDA（又稱AMPA）兩類。
NMDA受器本身即為孔道，可讓Na+與Ca2+進入，其開啟需要兩個條件：
1.麩胺酸接上受器
2.突觸後神經細胞膜要部分去極化
這是由於NMDA受器中具有Mg2+離子，Mg2+離子阻擋了孔道的流通。受細胞膜電位去極化的影響（約從-70 mV去極化至-40mV），可使Mg2+因電壓梯度而向外移開。故越多突觸前神經刺激，造成越多突觸後神經元的非AMPA受器開啟，使Na+進入，才可使去極化程度足夠使Mg2+移開，而使NMDA受器可活化。
(2) 進入細胞內的鈣離子需要和調鈣蛋白先組合，然後再和神經性一氧化氮合成酶（nNOS）組合形成活化的nNOS。
(3) 活化的nNOS催化L-精胺酸（L-arginine）製造L-西瓜胺酸（L-citrulline）和一氧化氮（NO）。
→nNOS的C端會和NADP+、FADH+、FMNH+結合；N端和BH4結合；而作用的中心氧化酶和還原酶則會和CaM（Calmodulin）有連結，結合後，促成的電子傳遞將電子由]還原酶傳給鐵離子，然後氧化Arginine成NO和Ctrulline。
(4) NO和GC的輔因子原血紅素（heme）的鐵離子結合，形成活化的GC。
(5) 活化的GC催化GTP製造cGMP。
→cGMP再活化PKG，最後磷酸化CREB-1（cAMP response element binding protein-1）；或者，PKG直接促使ER中的鈣離子釋放出來使細胞內鈣離子濃度上升，作用在adennylyl cyclase-1使其增加cAMP的生成並活化PKA，之後磷酸化MAPK；並促使其和CAMK II及CAMK IV移動至細胞核磷酸化CREB-1。
(6) NO也可滲透回去左邊的前突觸神經單元，而活化那邊細胞的GC及接下來的系列反應。這個滲透回去的信息傳導步驟可能在腦部學習、長期記憶及長期憂鬱扮演重要角色。
NMDA receptor
NMDA receptor是glutamate接受體之一種，位於突觸後之細胞膜上，在神經元之興奮性傳導，扮演重要的角色，對長期增益現象、長期抑制現象及學習記憶也十分重要，所以NMDA receptor數量或其功能之改變，會對突觸之可塑性有重要的影響。
NMDA receptor是由NR1、NR2及NR3次單位所組合而成。其中NR1是形成此接受體通道共同必須的，而NR2則決定此接受體離子通道之活性。另外NMDA receptor亦受到磷酸化與否之影響而改變其活性。當NMDA接受體被磷酸化時，其通道打開之機率會增加，而當被去磷酸化時，其通道打開之機率會降低。
N-methyl-D-aspartate（NMDA）receptor和LTP如先前所述，NMDA receptor 打開後，鈣離子會大量的進入後突觸神經細胞內。當鈣離子進入後突觸神經細胞後，會活化一些訊息傳導分子，這些傳導分子可以將訊息傳回前突觸神經末梢，使前突觸神經釋放神經傳導物質的量增加造成長期增益（long term otentiation；LTP）。
NO在免疫方面的作用
一氧化氮與巨噬細胞
巨噬細胞是我們在研究NO對免疫系統的影響時最常使用的題材之一，原因有二：
(1) 巨噬細胞體積龐大
(2) 巨噬細胞含有豐富的iNOS
以前傳統的研究証實了巨噬細胞之毒殺效應是取決於“呼吸爆發”（Respiratory Burst）──產生過氧化物，過氧化氫以及其他細胞毒殺媒介因子，然而目前証據顯示巨噬細胞系列（包括缺乏呼吸爆發型）仍然有抗寄生蟲、細菌以及對抗腫瘤細胞之活性，這意謂著細胞毒殺機轉有別種路徑存在。巨噬細胞獵殺功能需要精氨酸幫忙，它可經由細胞激素刺激或由細胞產生之亞硝酸鹽暨硝酸鹽刺激而產生，這意謂著一氧化氮操控著巨噬細胞有效機轉。進一步的研究已經指陳一氧化氮在免疫功能之重要性。
自由基毒殺路徑
自由基（free radicals）是一種「含有不成對電子的高反應且半衰期極短的不穩定活性氧化物」。不成對電子具有相當高的化學反應活性，會搶奪其他分子之電子來穩定自己的結構，因此會造成細胞傷害、粒線體功能喪失、細胞膜脂質過氧化、DNA破壞、加速個體老化並且增加致癌機率，相反的對細菌產生相同作用來抑止細菌對生物體的危害。有些自由基，如NO等負責神經訊息傳遞，但絕大多數的自由基都是對人體有一定的危害。
嚴重的是O2–會與NO作用形成NO的自由基（peroxynitrite，ONOO．），而ONOO．的作用活性大於O2–和NO，所以ONOO．對生物體所造成之傷害則更為嚴重。例如：攻擊粒線體電子傳遞、造成DNA與酵素損害、破壞細胞膜完整性與造成細胞凋亡（apoptosis），與細胞內的鈣離子過度累積有關。
ONOO．為高PK值，一旦和酸結合立刻會釋出OH．及NO2．：
OH．會造成脂質氧化、胺基酸芳香環氫氧化（hydroxylate）。另外，DNA的鹼基（base）guanine C8位置會被自由基攻擊形成8OHdG（8-hydroxy-2- deoxy- guanosine）形式的氧化傷害；形成DNA另一個氧化傷害的地方為purinic/apyrimidinc AP site。
NO直接毒殺路徑
誘發性一氧化氮合成酶 （iNOS）是誘發式，不需要鈣離子和調鈣蛋白，細胞素可直接誘發 iNOS 產生催化作用。
1. 受到起始刺激物：LPS/LTA/cytokine的誘發，負責誘發性一氧化氮合成酶 （iNOS）編碼的DNA在巨噬細胞核內將iNOS轉錄成mRNA。
內毒素（Endotoxin）：
A. 革蘭氏陰性菌細胞壁上的脂多醣體（LPS），LPS受器為CD14，正常表現在單核球和巨噬細胞的細胞膜表面上
B. 革蘭氏陽性菌細胞壁上的脂台口酸（Lipoteichoic acid, LTA）
細胞素（Cytokines）：
A. 刺激性細胞素 （cytokines）：伽馬干擾素 （IFN-g）、腫瘤壞死因子 （TNF）、第一型白血球間質 （IL-1）、第二型白血球間質 （IL-2）
B. 抑制性細胞素：b-腫瘤成長因子 （TGF-b）、第四型白血球間質 （IL-4）、第十型白血球間質 （IL-10）、巨噬細胞去活性因子 （MDF）
2. 再經過轉譯之後，形成活化的iNOS
3. 活化的iNOS會催化L-arginine轉變成L-cytrulline和NO
4. NO會經由擴散作用到周圍的腫瘤細胞之中
5. 之後會有三條抑制路線：
A. 抑制核醣核酸轉變成為去氧核醣核酸（抑制Ribonucleotide reductase）導致細胞無法複製DNA。
B. 抑制檸檬酸循環（抑制烏頭酸梅acnitase）導致細胞無法產生ATP。
C. 抑制電子傳遞鏈的產生導致細胞內的NADH無法被利用來製造ATP。
NOS的種類
Tissue expression Intracellular location Enzymatic activity Human cellular source
I nNOS Constitutive Membrane associated Dependent on Ca2+ Neuron, adrenal medullary, renal macula densa, astrocyte, glia
II iNOS Indusible Cytosolic Independent on Ca2+ Macrophage, monocyte, leukocyte, endothelium, smooth muscle
III eNOS Constitutive
Membrane
Cytosolic Dependent on Ca2+ Endothelium, platelet, smooth muscle
NOS在NADPH和O2為輔助型受質的存在下，將L-arginine氧化成NO和L-citrulline。三種同功的NOS結構極為相似且都需要FAD，FMN和heme iron為prosthetic group，並且需要BH4 為輔助因子。NOS分三類，為神經性（nNOS）、誘發性（iNOS）和內皮性（eNOS），是依照最初發現的地方而命名（各在神經突觸、巨噬細胞和血管內皮）。不過後來發現nNOS和eNOS不只存在神經突觸和血管內皮，所以較正確的用法是上述三種NOS各用第一型（NOS-I）、第二型（NOS-II）和第三型（NOS-III）來表示。其中第一型（NOS-I）和第三型（NOS-III）屬固定存在型，因此又歸類為cNOS（constitutive NOS），為持續型表現的酵素，產生的NO量較少，約在nM的範圍，其作用在局部，主要是調節生理功能，這兩種皆受到鈣離子的調節。另一類為誘導型iNOS，受到cytokine及微生物產物的調節，和鈣離子無關，平時雖然沒有活性，但是一經內毒素或是cytokine誘導就可以大量的NO，約為cNOS產生的一百倍，而且可以持續一段蠻長的時間。
NOS依照結構特性可分作兩個功能區塊，一為reductase domain，當中含有NADPH、FAD、FMN的結合區域；二為oxidative domain，當中則為calmodulin、hemegroup與substrate（L-arginine）的結合區域，此處即具有催化活性的區域。
NO的應用--威而剛(Viagra)
(1)陰莖勃起的成因
當特定的骨盤神經收到腦部傳來的勃起訊號時，便在陰莖海綿體製造釋放出NO，NO便活化GC以增加GTP製造cGMP將陰莖海綿體的平滑肌放鬆、使血管擴張，而讓血液灌入使陰莖勃起。
(2)陽萎(陰莖不勃起)的成因
PDE5（phosphodiesterase type5，第五型磷酸二脂酶）會促進陰莖海綿體cGMP的代謝消耗，當陰莖海綿體cGMP的量被消耗而不足時，陰莖將軟攤無法勃起。
威而鋼藉著抑制PDE5來減少陰莖海綿體cGMP的代謝消耗以增強一氧化氮的功能，而促進陰莖勃起。然而，如果不能在陰莖海綿體製造足夠的一氧化氮或cGMP，再多的威而鋼也無法使陰莖勃起威而鋼。
