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胞形态学检验仍为检验医学之基础
日期：2012-10-31 来源：本站原创
一、概述
细胞形态学检验是一项古老的技术，自显微镜发明后，人们就逐渐观察到了血液中存在不同的细胞成分，随后发现这些细胞来源于骨髓，在骨髓中存在更复杂的幼稚细胞群体。在发现细胞形态的改变与血液病的发生有着密切的联系后，应用骨髓穿刺技术将骨髓液抽吸制成薄膜片，染色后在显微镜下观察细胞成分的变化来分析诊断血液系统疾病。虽然历经百年，但是细胞形态学检验仍然是检验的重要内容，是检验医学之基础。
细胞形态学检验是一门技术，也是一门艺术。我国形态学检验的前辈刘志洁教授说过：“一日不看细胞，就会茶饭不香！”显微镜下各种细胞形态是一种五彩缤纷的世界，在众多不同的细胞中，你可以对疾病作出诊断；甚至可以把细胞形态描绘在纸上，这是一种境界！
随着技术的进步，除了显微镜性能种类不断提升外，观察细胞形态学方法也逐渐增加。此外现代免疫学、分子生物学的发展为细胞形态学检验提供了多元化的补充，发展成为多学科综合诊断，如WHO关于淋巴造血系统种类分类标准中规定的细胞形态学、免疫学、分子生物学、遗传学结合临床的诊断模式，有利于对疾病本质的认识。但是随之出现的问题使细胞形态学检验在某种程度上逐渐有被忽视的倾向。
二、细胞形态学检验的内容
细胞形态学检验内容是多方面的，对于血液常规来说，主要是指外周血细胞涂片的形态分类。在分析仪给出细胞数量及其它参数的同时，人工推制血膜片，经常规染色后在显微镜下行人工分类。现代血液分析仪可以通过流式细胞、化学染色等技术对细胞进行分类，甚至可以识别异常的细胞，但目前仍需要人工分类复核。也有仪器通过图象自动采集分析，并在人工复核下进行细胞分类，可以明显提高工作的效率。
对于血液病诊断来说，更重要的是骨髓细胞形态学检查。因为外周血细胞一般来自于骨髓，部分血液病细胞形态、成分的变化不能反映在外周血中。骨髓液抽吸出后，涂成薄的片子染色后在显微镜下进行细胞分类和形态观察，从而对疾病进行诊断。由于骨髓正常细胞形态多样，而且不同疾病可以出现多种多样的细胞形态变化，因此骨髓细胞形态学检查需要丰富的经验和耐心，也并非所有血液病通过骨髓细胞形态学检验都能得到明确的诊断。骨髓穿刺成功与否是决定骨髓细胞形态学检查质量的首要因素，但有时疾病本身的因素可以导致骨髓穿刺的失败，如骨髓纤维化、细胞极度增生等，而且抽吸的细胞也不能反映骨髓造血组织结构的变化。因此骨髓活检是对骨髓抽吸细胞检查一个有效的补充，也属于形态学检查的范畴，在部分血液病诊断中具有抽吸细胞检查所不能的优越性。
血细胞形态、骨髓细胞形态、骨髓活检以及骨髓活检组织印片的细胞形态学检查的联合似乎是细胞形态学检查完美的模式，但是对于所有患者都进行这些检查，可能存在一定的困难，而且有时也是不必要的。对于疑难性疾病的诊断，这种“四片联合”的形态学检查可以提供完善的形态学信息。
三、骨髓细胞形态学检验的适应症
骨髓检查是一项创伤性检查，会给病人带来一定的痛苦和风险。而且骨髓细胞学检查属于显微镜人工检查，较为费时，工作人员必须具备坚实的血液细胞形态学理论基础和实践经验，又要具备临床血液病学理论和经验。因此，需要掌握骨髓检查的适应症。以下是需要行骨髓细胞形态学检查的情况：（1）无法解释的小红细胞症和大红细胞症；（2）不明原因的贫血；（3）不明原因的血小板减少；（4）血片中见到幼稚红、白细胞，疑有骨髓浸润；（5）疑有急、慢性白血病；（6）评价急、慢性白血病治疗效果；（7）骨髓增生异常综合征；（8）其它骨髓增生性疾病；（9）淋巴瘤；（10）毛细胞白血病；
（11）多发性骨髓瘤；（12）脂质积储病；（13）全血细胞减少；（14）不明原因的发热等。
但是在实际工作中，其他内科疾病，甚至是某些外科疾病，都把骨髓细胞形态学检查作为一种疾病诊断的常规检查，导致行此项检查的患者数量明显增加。在重视效益的医疗体系中，骨髓细胞形态学检查面临比较困难的境地。
四、骨髓细胞形态学检查技术
1．取材
骨髓取材一般选择骨髓红髓增生部位，采用的部位为髂后上嵴或髂前上嵴部位。因为该部位骨面较平，髓腔较大，易于采集并适于同时采集骨髓活组织，其中以髂骨后上嵴最为常用。对于儿童，更多地采用胸骨部位穿刺。对于灶性增生异常或特殊要求的，可在病灶部位穿刺或在CT等引导下穿刺，这样更容易得到病灶处的异常细胞信息。
骨髓取材是有创性操作，有一定的风险，要求由专科医生进行。取材需要注意的是尽量避免骨髓被大量血液稀释。首先要求操作者有一定的经验，掌握穿刺时手的力度是关键。文献及教材中均提及采集量0.2ml左右，实际操作中抽吸的注射器中出现的骨髓液量达到能够推出一大滴即可，足够推制10张左右的骨髓片。现代血液病诊断是多方面的，常同时做免疫表型、细胞遗传学、分子生物学或细菌培养等检验，在采集完涂片标本后就可以继续抽吸较多量的骨髓血，加入各自检查要求的试管中。
骨髓活检取材一般和骨髓涂片同时进行，二者有时略有冲突。如果先采集骨髓涂片，再采集骨髓活检，有可能造成骨髓组织中细胞被不同程度抽空，组织结构破坏；如果先行骨髓活检，再行骨髓涂片，由于已经有组织损伤可能启动了外源性凝血途径，涂片的标本可能迅速凝固，影响细胞形态的观察，这要求操作者有一定的经验。一般可选择先行骨髓活检取材，再避开原进针点再采集涂片，有时可根据具体需要选择哪个标本采集在先。
如发现骨髓已被大量血液稀释，亦可在玻片上进行简单的骨髓细胞浓集：将骨髓液滴于一玻片上，立即将玻片倾斜或用一带针头的注射器吸取血滴中的血液，剩余的部分制片可以达到一定浓集的目的。部分患者稀释是因为骨髓纤维化或细胞极度增生塞实骨髓腔所致，此时应立即决定同时行骨髓活检。
有文献报道用抗凝的方法采集一定量的骨髓液，行骨髓细胞总数计数及分类计数，也可在沉淀后根据分层情况评价骨髓的增生程度，在浓集的细胞层中易于发现较大的特殊细胞(如肿瘤细胞、巨核细胞、吞噬细胞等)。但是我们知道骨髓细胞形态学检查的核心目的是血液病的实验室诊断，细胞分类计数有助于血液病的诊断与分型，而绝对计数意义相对较低，尤其在目前人员紧张的条件下，把其作为常规应用是不现实的。另外，采集骨髓的操作对细胞数量影响非常大，所采集的标本进行抗凝绝对计数意义是有限的。但是给我们启发的是若遇到外周血中少量异常细胞时可采集这种方法浓集细胞进行形态学检查有助于发现异常细胞成分。
2．常规染色
细胞形态学检查常规罗氏染色(即瑞氏一姬姆萨染色)，细胞不同结构对染料中不同成分亲和性不同，因而着色各异。经过这种染色，细胞的核、浆、内容物均可以清楚地显示，从而辨认出不同系列、不同阶段的细胞。也有采用单纯的瑞氏染色，可以达到同样的效果，区别在于前者核的着色较限制。不同实验室有自己的染色习惯，并不影响细胞的识别。
细胞染色的质量对于形态学检查至关重要，尤其对于骨髓标本，因为其细胞成分远远复杂于血涂片。良好的染色，细胞着色要均匀，深浅合适，背景干净无染料沉渣，细胞色彩对比鲜艳，胞浆中颗粒成分显示清晰。对于细胞形态检验，常规染色是一项重要的基本功，但现在常常被忽视。比如在血液常规检验中，染色的酸碱度不合适时，某些异淋细胞和单核细胞难于区分，骨髓中细胞着色不清晰时可能将一些早中阶段的粒细胞误认为原始阶段的细胞。
3．细胞化学染色
化学染色作为常规染色方法的补充，对于细胞形态的鉴别具有重要的作用，即使是在现代方法手段先进的今天，仍然有其一定的应用价值。但是细胞化学染色存在操作繁琐、特异性不够强、方法难以标准化等因素，因此我们必须客观地对待细胞化学染色。在众多的染色项目中，过氧化物酶染色、铁染色法、特异性酯酶染色具有较明确的意义；糖原染色有助于原始细胞性质的鉴别，以及鉴别红白血病或骨髓增生异常综合征中异常的幼红细胞；中性细胞碱性磷酸酶在慢性髓性白血病初筛中仍有一定意义。
过氧化物酶染色鉴别细胞的方法目前已经开始应用于血细胞分析仪的白细胞分类，同时也有助于对异常的血细胞进行初步的鉴别。那么可以设想，能否应用不同的染色结合以及细胞的流式分布特点，设计出可以对骨髓多种细胞进行精确系列阶段分类的机器，那样就可以大大提高骨髓细胞形态学检查的效率。细胞化学染色方法一般各个实验室都是延用自己多年的传统方
法，手工配置，可以达到较好地效果。近年来有开发基于国际血液学标准化委员会推荐方法的染色试剂盒，在一定程度上减轻了染色的复杂性，有利于染色的标准化。但是对于本来收费较低的项目，有时候可能连染色的成本都不及。
免疫细胞化学染色在细胞形态学检验中也有一定的应用，但是近年来流式分析进一步上得到广泛应用，同时可以标记系列性的抗体，基本取代了片膜上进行的免疫化学染色。在小巨核的识别、某些不易获取流式标本的异常细胞识别中，免疫细胞化学染色仍可以发挥特定的作用。
五、骨髓活检技术
涂片的细胞形态学检查的优点是能够直接显示骨髓各系统细胞的形态，易于识别，但其也存在不足，如由于造血细胞分布的不均一性，抽吸细胞的比例分布并不能完全反映骨髓的真实情况；无法显示造血基质中造血细胞及其前体的空间定位等；有时由于纤维化或细胞极度增生导致的抽吸细胞失败。因此需要骨髓活组织学检查（骨髓活检）作为有效的补充。
骨髓活检采用一种环钻的穿刺针采集一骨髓活组织，早期常采用普通的病理学方法进行标本的制作。但是由于骨髓组织内细胞成分复杂，没有其他器官中组织分布的特异性，因此给诊断带来了难度。目前常采用塑料包埋薄切片技术进行处理，不需要脱钙处，更好地保持了骨髓组织原貌，获得的切片染色后能够显示细胞的清晰结构，易于准确辨认甚至可以在骨髓活检切片上行细胞的分类计数。
塑料包埋方法主要的缺点是制作较复杂，影响了报告诊断的效率。另外由于塑料聚合时产生大量的热量，可能破坏细胞表面的抗原，因此免疫组化很难进行；或者需要更特殊的处理方法，但是目前不适用于临床常规免疫组化的应用。在多数血液系统疾病的诊断中，免疫组化的作用尚没有普通病理诊断重要，因此权衡对于诊断的利弊，工作中更多地采用了塑料包埋方法，多数脱离了普通的大病理范畴而归属于血液病实验室。血液病的免疫学检查更多地依赖于流式细胞分析，在特殊需要的情况下，可取两种方法的优点，先行塑料包埋切片做诊断，若发现异常不能明确诊断时可再次取活检做石蜡包埋切片免疫组织化学分析，这也是实际工作中常常采用的方法。但是不利之处是两次方法先后进行，耽误了诊断时间。在国外有采用一次骨髓取材，同时进行两种骨髓活检方法的处理，虽然节约了时间，但对多数病例而言明显增加了无谓的工作，在我国尚没有得到推广。
六、血液病的细胞形态学诊断
在获得良好的涂片后，显微镜下分别用低倍和高倍镜观察细胞形态，进行细胞比例分类，结合细胞化学染色，最后予以一定的诊断或意见，这是骨髓细胞形态学检查的模式。对于细胞分类计数，是否所有标本都需要详细的分类计数？虽然目前大家都沿用传统的分类，但是以下因素是需要思考的：（1）细胞比例能否完全反映骨髓真实情况？（2）分类比例是否是所有血液病诊断所必须的？
前面介绍抽吸的骨髓不可避免地被血液稀释，稀释的程度不可预知也难以控制；骨髓本身的不均一性以及涂片中细胞分布的不均一性，都造成细胞分类比例只具有相对意义。曾经遇到一病例，在一天时间内行2次骨髓穿刺，分别在左右两侧髂后取材，一侧骨髓标本提示原始细胞在30%以上，而另一侧只有10%不到。因此有时说“看”骨髓比“分”骨髓更有意义。即便是白血病的诊断，也不全部以原始细胞比例来定。由于检测技术的进步，新的诊断标准中已经认为对于出现特定分子生物学标志的患者，即便原始细胞不及诊断标准也可以诊断白血病。因此应该具体看待细胞分类。目前有部分专家对于会诊标本，根据骨髓片和外周血片的细胞形态，结合必要其他信息，文字叙述检查所见并提出诊断意见，也是一种可行的选择。
当然，量化的结果易于比较，无论是横向还是纵向的。所以常规工作中还是必要的，尤其是疾病治疗过程中的观察。如果能做到根据临床或疾病的需要有所侧重，则可能起到减轻繁重的工作量的作用，但本身却又是一个很难掌握的度。
血液病的诊断是一个复杂的问题，有时并不是细胞形态学检查能解决的问题。因此对于从事此项工作的人员来讲，仅仅的形态学知识是不够的，需要进一步学习掌握疾病的临床知识、诊断的其他要素等。在形态学检查时，从疾病诊断的角度去衡量形态学意见与临床及其他检查结果时候是否有矛盾之处，有时相似的细胞形态可能属于不同的疾病范畴，如果仅仅局限于细胞形态学，则可能要犯错误的。另一方面，首先通过化验单或其他途径了解患者病情，可以首先提供一个阅片思路，需要特别注意细胞成分等，这样也可以避免浪费不必要的时间，提高阅片的工作效率。实际工作中有少部分临床医生认为让检验人员了解病情会误导骨髓检查，因此不提供或故意隐瞒或修改患者临床信息，他们忽略了骨髓细胞形态学检查并非科研工作，这种双盲对照是不必要的，也是不可取的。
在细胞形态学检查中，最重要的是报告的意见，包括诊断意见和进一步检查的建议。经典的教科书都把意见基本分为4类：可以明确诊断的；符合性诊断的；疑似诊断需要进一步检查的；难以给出明确诊断仅做形态描述的。自从我国出台出具诊断性报告的人员必须具有执业资格的医师后，因为目前该专业的人员还是具有丰富经验的技术人员为主，医师为数较少，所以骨髓报告最重要的部分逐渐变成空白，或大量的重复性描述性词句，或“可能性大、考虑、不除外”等等。在执行新政策的衔接过度阶段，骨髓形态学报告质量的下降，一定程度上降低了骨髓细胞形态学检查的意义，这是需要关注的一个问题。
七、细胞形态学检验的质量控制
细胞形态学检验是一项特殊的检查，同样需要全面的质量控制，才能保证报告的可信度。可以从分析前、分析中和分析后几个环节来考虑。
在分析前，对于临床医师，需要填写齐全的化验单，除了患者信息，还应该提供患者的临床主要病历、主要体征、临床拟诊及检查的主要目的等；然后就是留取合格的标本，前文已经提及。对于检验者，需要具有丰富的形态学工作经验，是骨髓形态学检查最重要的因素。分析中染色技术部分，可以按照工作常规进行，质量控制内容与一般检验项目无异；而对于阅片工作，除了遵循阅片工作流程，重要是依靠阅片者的主观能动性，这必须是长期的积累和学习才能够提高的，而非什么文件规定可以实现的。专家的高明之处也体现在这一环节。同时阅片者还需要高度负责的态度，不放过细胞形态中任何成分。在分析后除了常规报告及标本处理外，还注意需要和患者以前的报告进行对比，是否与临床病情相符，这样才能放心地发出报告。
八、细胞形态学检验现状分析及对未来的展望
细胞形态学是一门古老而又成熟的检验技术，有系统的工作程序，因而能保证工作顺利开展；通过学校的教育和不同级别医院的进修学习，人员也能够得到有效的培训和继承，保证这项传统的技术代代相传。但是在技术飞速发展的当前环境下，同样面临许多困难。首先是人才相对匮乏，细胞识别技术是很烦琐的工作，费时费力，缺乏效益，本来愿意从事的人员偏少，加上准入的门槛抬高，就更加重了困难。对细胞形态学检查认识也存在误区，有的认为有了先进的检查手段后细胞形态学检查就没有必要了，也有部分片面强调细胞形态学的作用，忽视分子生物学等检查对疾病本质的诊断、预后判断方面的价值，要么妄自菲薄要么妄自尊大，这些都是不可取的。硬件方面，显微镜等设备也不易得到有效的更新。就这些问题，提出一些建议或未来发展的可能方向。
1．人才培养
细胞形态学检验在学校阶段仅仅是基础，远不够工作的需要，重要的是工作后的经验积累和继续教育。细胞形态学检验一部分是在血液科实验室，还有一部分在检验科中。在血液专科中，人员临床知识的积累、阅片的提高都较容易一些；而对于检验科中，由于与临床的脱节，如果不注意就会发生思维局限性，另外检验科人员的流动等都不利于人才的成长。这样就需要人员相对固定，加强与临床科室的沟通，积极参加临床科室的教学或临床查房，有条件可参加一段时间血液科的临床工作，要充分认识细胞形态学检验的重要作用及局限之处。
在人员更新过渡阶段，实验室有丰富经验的技术人员在细胞形态学检查中还是具有一定的优势，规定马上都要由医师进行有点操之过急。如果在人员更新的过度时期，在政策上有上适当变通，一方面有利于细胞形态学报告的质量保证，也有利于新的人员逐渐地成长。
2．改善硬件设备条件，提高工作效率
由于是手工项目，标本量的增加和从事人员的减少给细胞形态学检查带来的矛盾是明显的，所以提高工作效率是重要的一个环节。为什么外周血细胞分类能够由仪器进行初筛，而骨髓却不能呢？其实仔细分析，这也并非永远不能实现。仿照外周血的分类原理，骨髓的自动分类也可以从2个角度去考虑：一是可以联合某些化学染色，结合细胞流式分析的特点对细胞进行系统、阶段的划分；另一是可以自动采集大量细胞图象，由设定的程序进行识别，根据意见进行人工复核。原理并不复杂，只是细胞成分复杂于外周血，因此需要识别更复杂的细胞全体的仪器系统；采用图象采集分析原理就更简单了，需要足够大的细胞形态数据库就有可能实现目标。因此如果有志于研究这一方面的公司积极开发努力，将会给细胞形态学检查带来一场革命。
在实现仪器自动化分析之前，可以通过计算机辅助功能在一定程度上提高工作的效率。例如目前越来越多采用的图文报告系统，在减轻登记查询的繁琐外，还可以给临床医生提供一定量的细胞图象信息。图文报告系统目前存在的问题是图象清晰度还有限、价格偏高，而且常常是阅片分类写完报告再输入及图象采集，增加了工作量。因此在提高图象质量的同时，降低系统成本，能够使细胞分类、报告书写、图象采集在机器上同时实现，就确实起到提高效率的作用。另外网络化的建设，可以使临床医生同时得到细胞数量和形态的信息。在统一报告系统、加强横向联系的基础上，可以由专科学会牵头组织专家形成全国性的网络性的细胞形态会诊中心，必将极大地提高我国细胞形态学检验的整体水平。
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