成功的开始：DNA提取

基因组DNA的提取概述

成功的开始——DNA提取

DNA的提取通常用于构建文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。

不同生物（植物、动物、微生物）的DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。

本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料，学习DNA提取的一般方法。

提取植物组织DNA

成功的开始——DNA提取

一、材料

水稻幼苗或其它禾本科植物，幼嫩叶子。

二、设备

移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。

三、试剂

1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris?Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5% SDS。

2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240μl巯基乙醇，加水至300ml。

3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

4、RnaseA母液：配方见第一章。

5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。

四、操作步骤

（一）水稻幼苗或其它禾木科植物DNA提取

1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ，60℃水浴预热。

2.水稻幼苗或叶子5-10g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30-60分钟(时间长，DNA产量高)，不时摇动。

3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀(需带手套，防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟，使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。

4.室温下5000rpm离心5分钟。

5.仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6.在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。

7.如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。

8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。

9.加入5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃ 10分钟，除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。

10.加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀。

11.用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。

12.将DNA重溶解于1ml TE，-20贮存。

13.取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。

[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA，足供RFLP、PCR等分析之用。

（二）.从李(苹果)叶子提取DNA

1.取3-5克嫩叶，液氮磨成粉状。

2.加入提取缓冲液Ⅱ10ml，再研磨至溶浆状。10000rpm，10min。

3.去上清液，沉淀加提取液Ⅰ20ml，混匀。65℃，30-60min，常摇动。

4.同本节（一）中步骤3-13操作。

提取动物组织DNA

成功的开始——DNA提取

一、材料

哺乳动物新鲜组织。

二、设备

移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。

三、试剂

1、分离缓冲液：10mmol/L Tris?Cl pH7.4，10mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA。

2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。

四、操作步骤

1.切取组织5g左右，剔除结缔组织，吸水纸吸干血液，剪碎放入研钵(越细越好)。

2.倒入液氮，磨成粉末，加10ml分离缓冲液。

3.加1ml 10% SDS，混匀，此时样品变得很粘稠。

4.加50μl或1mg 蛋白酶 K，37℃保温1-2小时，直到组织完全解体。

5.加1ml 5mol/L NaCl，混匀，5000rpm离心数秒钟。

6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后，3000rpm离心 5分钟。

7.取上层水相至干净离心管，加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。

8.移去上层乙醚，保留下层水相。

9.加1/10 体积3mol/L NaAc，及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。

10.用玻棒钩出DNA沉淀，70%乙醇中漂洗后，在吸水纸上吸干，溶解于1ml TE中，-20℃保存。

11.如果DNA溶液中有不溶解颗粒，可在5000rpm短暂离心，取上清; 如要除去其中的RNA，可加5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃保温30分钟，用酚抽提后，按步骤9-10重沉淀DNA。

细菌DNA的提取

成功的开始——DNA提取

一、材料

细菌培养物。

二、设备

移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。

三、试剂

1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O，缓慢加入10g CTAB，加水至100ml。

2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。

四、操作步骤

1.100ml 细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。

2.加9.5ml TE悬浮沉淀，并加0.5ml 10% SDS，50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K，混匀，37℃保温1小时。

3.加1.5ml 5mol/L NaCl，混匀。

4.加1.5ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20分钟。

5.用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。

6.用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干净管中。

7.加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，沉淀DNA。

8.用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于1ml TE，-20℃保存。如DNA沉淀无法捞出，可5000rpm离心，使DNA沉淀。

9.如要除去其中的RNA，可以按本章第三节中操作步骤处理。

DNA的纯化浓缩

成功的开始——DNA提取

一、目的

将复杂的细胞分子混合物加入有机溶媒萃取以除去蛋白质及其它成分，就可以纯化DNA。一般常用酚及氯仿(phenol/chloroform)可使蛋白质变性(denaturaion)的特性来进行萃取的步骤，DNA和RNA不溶于有机溶媒中，而溶于水层。另外，分子选殖(molecular cloning)常利用洋菜胶(agarose)来分离不同大小的DNA片段或用以纯化DNA。

核酸定量可利用核酸会吸收260及280 nm波长的UV光，而且可与荧光染剂ethidium bromide (EtBr)键结，这些物理特性即一般定量DNA的的基本原理。此外亦可藉由UV光的吸收来评估DNA的纯度，若纯化DNA的量足够时，可用光谱分析法定量，当DNA量少或不纯时，才用EtBr键结方法。(注意：EtBr为致癌剂，操作时务必带手套，并禁止戴手套的手到处乱摸!)

二、溶媒萃取法

1.仪器用具

(1).桌上型离心机

(2).37℃恒温箱

(3).排烟柜

2.药品及试剂

(1).phenol/chloroform = 1：1

(2).chloroform/isoamylalcohol = 24：1

(3).RNase A：1mg/ml (100 加热30分钟去除DNase活性)

(4).100% ethanol

(5).TE buffer

3.方法步骤

(1)由实验1中小量制备的DNA样品，加入RNase A以去除RNA，其终浓度为10-20 mg/ml。

(2)加入50 ml TE buffer混合均匀。

(3)加入100 ml phenol (注意! phenol对皮肤具腐蚀性药品，务必带上手套并在排烟柜中操作)，混合均匀使溶液形成混浊状，这样可以避免震荡及搅拌时所产生的拉力将DNA弄断。

(4)12,000 rpm离心20秒，小心用pipetman把上层液取出到另一离心管。

(5)加入100 ml phenol及100 ml chloroform以萃取刚才收集到的上层液，重复步骤4。

(6)加入200 ml chloroform萃取上层液，并重复步骤4。

三、浓缩质体DNA

1.仪器用具

(1).桌上型离心机

(2).真空干燥器

2.药品及试剂

(1).3 M sodium acetate (NaOAc),pH 5.2

(2).100% ethanol

(3).TE buffer

3.方法步骤

(1)加入1/10体积的sodium acetate于DNA溶液中，使其最终浓度为0.3 M。

(2)加入2.5倍体积100% Ethanol (EtOH)混合后，置于-20 中30~60分钟(若DNA小于1kb或量少于100 ng/ml，应把溶液放在-70 下2小时，若DNA小于200 bp时，加入10 mM MgCl2 有助于DNA回收。)

(3)12,000 rpm离心10分钟，倒掉上清液，置于真空干燥器10分钟。

(4)加50 ml TE buffer or water，再次悬浮DNA，保存样品DNA于4 。

四、胶体核酸回收法

1.仪器用具

(1).桌上型离心机

(2).干浴器

2.药品及试剂

QIAqiuck gel extraction kit (Qiagen)或其它厂牌。

3.方法步骤

(1)质体DNA经限制酶切割后，以含EtBr之1% agarose gel进行电泳，电泳后以长波长UV灯观察DNA片段所在位置，并以干净刀片将之切下，尽可能切越小越好。

(2)取一微量离心管，秤重后再将切下的胶体置于管内再秤重，以估计胶体重，每管胶体不超过400 mg，加入3倍体积之QG buffer (即每100 mg胶体加入300 ml QG buffer 。

(3)置入50 干浴器(内放水)水浴10分钟，期间可每隔2~3分钟以手指轻弹管壁以加速胶体完全溶解。

(4)加入胶体一倍体积之异丙醇混合均匀，此时溶液为黄色(为原本QG buffer的颜色)。

(5)将QIAquick spin column置于2 ml离心管中，加入上一步的gel solution，12,000 rpm 离心一分钟。（此spin column之最大容量为800 ml，若样品体积超过800 ml，则需分次加入）。

(6)离心后，倒掉离心管流出液，将spin column置回原离心管中，加入750 ml PE buffer，静置5分钟。

(7)13,000 rpm离心1分钟，到掉流出液，将spin column置于原离心管中，重复13,000 rpm离心1分钟。

(8)将spin column置于另一个干净的1.5 ml离心管中，加入10~15ml EB buffer或水到silica membrane上，静置1分钟。

(9)13,000 rpm离心1分钟，丢弃spin column，此溶液即为浓缩DNA供下一个定量或接合反应（ligation）。

DNA质量检测

成功的开始——DNA提取

上述方法得到的DNA一般可以用作Southern，RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同，得到的DNA产量及质量均不同，有时DNA中含有酚类和多糖类物质，会影响酶切和PCR的效果。所以获得DNA后，均需检测DNA的产量和质量。

1.DNA溶液稀释20-30倍后，测定OD260 /OD280 比值，明确DNA的含量和质量。

2.取2-5μl 在0.7% agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。

3.取2μg DNA，用10单位(U)HindⅢ酶切过夜，0.7% agarose胶上电泳，检测能否完全酶解(做RFLP，DNA必须完全酶解)。

如果DNA中所含杂质多，不能完全酶切，或小分子DNA多，影响接续的分析和操作，可以用下列方法处理：

（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。

（2）酚:氯仿抽提，去除蛋白质和多糖。

（3）Sepharose柱过滤，去除酚类、多糖和小分子DNA。

（4）CsCl梯度离心，去除杂质，分离大片段DNA(可用作文库构建)。

3.Spectrophotometer定量法

测定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下：

(1).ds DNA (double stranded DNA)= 50 mg/ml

(2).ss DNA (single stranded DNA)= 40 mg/ml

(3).oligonucleotide = 33 mg/ml

4.Ethidium bromide定量法

利用一系列不同浓度的DNA标准溶液（0、2.5、5、10、20、30、40、50 ng/ml），或已知浓度的DNA marker，和未知浓度DNA样品一起进行琼胶（洋菜胶）电泳，以EtBr染色后，于UV灯箱上照相，比较标准浓度及未知浓度的亮度，来求取DNA 的含量。

5.测定DNA纯度

测定样品在260 nm及280 nm吸光值之比较，由数值大小判定DNA的纯度。OD260 /OD280 ＝1.8表示DNA的纯度高，若数值<<1.8，表示纯度低，故单由OD260 测得的DNA含量较不可信。

技术支持

成功的开始——DNA提取

尚柏生物医学技术（北京）有限公司创建于2000年，已经获得国家经营三类医疗器械许可（证号：京081876）和北京市科学技术委员会认定的高新技术企业（统一编号：0611008A21672）。公司致力于尖端免疫学和分子生物学技术在科研中的应用与推广，专业从事免疫检测及其他相关产品的引进、服务和研发。目前已经拥有自主知识产权专利产品6项。公司能够承担的实验项目有：普通PCR、荧光定量PCR（real-time PCR）、Western印迹、流式、ELISA、免疫组化、细胞培养、放免、实验动物饲养及造模等。同时本实验室人员有丰富的新药研发企业工作经验，能够承担新药药效学及毒理学实验，提供新药申报资料、文献查询及综述内容的整理服务。