在上一期《质粒构建:从入门到精通之初窥门径》中我们介绍了构建质粒的方法,囿于篇幅原因,很多零碎知识并未做详细介绍,所以在本文中我们将介绍以下内容:1. TRIzol法抽提RNA;2. 逆转录法合成cDNA;3. 转化;4. 质粒的小量提取;5. 测序后序列的比对(DNAMAN的使用)。另外我们将在下期《质粒构建:从入门到精通之高手进阶》中介绍Kozak序列、标签的添加方法、如何判断是否移码等内容,敬请期待! 读完本文您将获得以下技能 0. TRIzol法抽提RNA; 1. 逆转录法合成cDNA; TRIzol法抽提RNA 提取RNA比较成熟的方法便是TRIzol法抽提,Invitrogen的TRIzol是比较稳定且广泛应用的,当然现在一些国产的TRIzol类产品也能满足大部分情况下的RNA抽提。 ABOUT TRIzol 注意事项及原理 注意事项: 2、TRIzol试剂具有较强毒性,如沾到皮肤立刻用大量的清洁剂和水冲洗! 溶液配方及原理: 2、氯仿:氯仿可增强TRIzol中的8-羟基喹啉对RNase的抑制作用。另外氯仿作为有机溶剂,加入氯仿后离心可使溶液分层,上层为水相,下层为有机相。苯酚为弱酸性,酸性条件下(一般为Ph5.0)DNA和蛋白质进入有机相,而RNA留在水相;反之亦然,弱碱性(Ph8.0)时DNA留在水相。 3、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇:异丙醇和乙醇能与水任意比例互溶,因此加入异丙醇能够夺取RNA周围的水分,使其脱水沉淀。 4、DEPC水:DEPC是RNase的化学修饰剂,它与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制其活性。DEPC有毒性,操作时应小心。谁说是最优秀的;谁是最自由的,谁也就是最优秀的,在他们身上,才会有最大的美。 操作步骤 1、细胞破碎 如果样品中含有较多的蛋白、脂肪、多糖或其他细胞外物质,如肌肉、脂肪组织或植物的块根等,可在2℃~8℃,12000×g离心10 min去除这些物质。 关于TRIzol的用量,Invitrogen官方说明书中有建议用量: 一般情况下,根据细胞量的多少小编的用量是:2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish(仅供参考) 加入与水相等体积的异丙醇,室温孵育10 min。12000×g,2℃~8℃离心10 min。RNA沉淀一般附着在远离离心机轴心的管底,为无色胶状。 Note:TRIzol不仅仅可以提取RNA,还可以同时提取DNA和蛋白质!具体参见TRIzol官方说明书,公众号内回复“TRIzol”获取下载链接! 逆转录法合成cDNA 一般逆转录(也可称作反转录)都有现成的试剂盒,只要大家按照试剂盒的说明书来操作,问题都不大,在这里小编就以TAKARA的逆转录试剂盒为例稍加说明。 Random 6 mers为随机的6核苷酸引物,引物序列为5'-(P)NNNNNN-3',特点是产物量大,特异性差,适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。 Oligo dT Primer适用于具有Poly(A)Tail的RNA,因而特异性好,但因其只结合Poly A尾巴,对于较长的mRNA,经常不能延伸到5'端。(原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly(A)Tail)。 两种引物可据实际情况使用一种,也可同时使用。还有一种情况,当只扩增一种目的基因时,也可以使用Specific Primer(PCR时的下游引物)作为反转录引物。 操作步骤 步骤简述如下:按照下图中1配制溶液,然后65℃处理后加入3中所配制溶液继续后续反应即可。 连接产物的转化 常用的感受态细胞有DH5α、BL21(DE3)、Rossetta等,而抽提质粒一般用DH5α,可以自己制备也可以购买商业化的感受态。 ABOUT Transformation 注意事项 1. 感受态细胞要现用现融,刚刚融化的感受态转化效率最高; 操作步骤 1. 取50 μL感受态细胞置于冰上融化; 2. 加入5 μL连接产物(质粒一般只需用白色枪头沾取一下即可),混匀,置于冰上静置30 min(此时应该打开水浴锅并调温至42℃); 3. 42℃水浴中热激90 s,迅速置于冰上静置2 min; 4. 加入500 μL无菌的LB培养基(不含抗生素),混匀后置于37℃,200rpm的恒温摇床中培养1 h,使细胞复苏; 5. 连接产物:3000 rpm离心5 min,弃上清,留取少量LB(50 μL左右),重悬沉淀,全部均匀涂布于LB培养板(需含相应抗生素)上,37℃ 倒置培养 16~18h;质粒:直接取20~50 μL涂于LB培养板上培养即可。 质粒的小量提取 ABOUT 质粒抽提 实验原理: 较常用的质粒提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂(如Triton和SDS)裂解法。前两种方法比较剧烈,适用于较小的质粒(<15kb)。去污剂裂解法则比较温和,一般用于分离大质粒(>15kb)。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒的方法,其原理为:当细菌暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中,会使细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性,将质粒DNA释放到上清中。 由于质粒DNA分子比染色体DNA大得多,且前者为共价闭合环状分子,后者为线状分子。只要碱处理的强度和时间不要太过,当pH值恢复到中性时,质粒DNA双链就会再次形成。 在裂解过程中,细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会互相缠绕成大型复合物,后者被十二烷基硫酸盐(SDS)包盖。 当用钾离子取代钠离子时,这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去沉淀之后,就可以从上清中回收复性的质粒DNA。 本方法采用Tiangen小提中量试剂盒进行提取,其纯化系统是硅基质吸附材料,其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。 实验试剂(试剂盒试剂配方不清楚,以下配方见《分子克隆实验指南》) 1、溶液P1:50 mM葡萄糖,25 mM Tris-Cl(pH 8.0),10 mM EDTA,100μg/ml RNase A 原理:Tris-Cl用于提供一个合适的缓冲体系;50 mM葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部;而EDTA 作为Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,起到了抑制DNase的作用;RNase作用为去除质粒中混有的RNA,其不受EDTA的影响。 2、溶液P2:0.2 N NaOH,1% SDS 原理:0.2 N NaOH的作用在于使细菌裂解,而SDS作用在于加入P3之后是被其包盖的细菌蛋白,染色体DNA一起作为沉淀析出。 3、溶液P3:3 M 醋酸钾,2 M 醋酸 原理:这一步的K+置换了SDS(十二烷基磺酸钠)中的Na+,得到PDS(十二烷基磺酸钾)沉淀;SDS易与蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了,同时染色体DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和碱,使溶液恢复中性,从而使质粒DNA复性。 操作步骤 1、将过夜培养的菌液(5-15ml)从摇床中取出,并拧紧盖子,9000 rpm离心10 min,用泵尽量吸除上清。若暂时不提取,可将沉淀保存于-20℃,也可直接将菌液保存于4℃(短时间)。 2、柱平衡步骤:向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm(-13400g)离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中(请使用当天处理过的柱子)。 3、向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA,并置于冰上 ) ,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀,并移至2ml离心管中。如果沉淀的菌体较多,则相应增加P1的用量(之后P2和P3的用量也应成比例增加),并分到几个管子中分别进行步骤4和5的操作(不然P1+P2+P3的总体积超过2ml离心管容积),步骤6过上清时可过同一个吸附柱。 4、向离心管中加入500μl溶液P2 ,温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。由于P2裂解不应超过5 min,以免质粒受到破坏。故加入P2前将计时器定时4 min,以免超过时间。但是时间也不可过短,以免裂解不彻底。每管操作时间尽量一致。 5、向离心管中加入700μl溶液P3(记得冰上预冷),立即温和地上下翻转6-8 次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。放置冰上10min,之后12000rpm ( -13400g )离心10 min,此时在离心管底部形成沉淀。如果上清量较大,需要多次过柱,可将上清转移至新的离心管中,以免沉淀飘起。 6、将上一步收集的上清液分次加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中,其容量为750-800μl),注意尽量不要吸出沉淀。 12000rpm(-13400g )离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。 7、可选步骤:向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD,12000rpm(-13400g )离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。 8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇),12000rpm(-13400g)离心1 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。 9、重复操作步骤8。 10、将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm(-13400g )离心2 min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 注意:漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR 等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱开盖,置于室温放置数min,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 11、将吸附柱置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μl洗脱缓冲液EB(65℃预热),室温放置或65℃水浴2 min,12000rpm(-13400g )离心2min将质粒溶液收集到离心管中。 注意:为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中.重复步骤 11、洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液,应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内(可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围), pH 值低于7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μl,体积过小影响回收效率,但也不应过大,以免所提质粒浓度过低,影响后面的使用。且DNA产物应保存在-20 ℃ ,以防DNA 降解。 结果判断 (2)应该注意的是作为空白对照的blank管稀释方法应该和所测样品管一样(如样品为2μl所提质粒+48μl ddH2O,则blank为2μl洗脱液+48μl ddH2O)。 2、酶切鉴定,并用琼脂糖凝胶电泳检测 (2)所提质粒(未酶切)的电泳条带可能为一条带,也可能为二到三条带,这是因为质粒提取过程中操作过于剧烈可能使环状超螺旋结构的质粒DNA单链出现缺口(保持环状,失去超螺旋),或双链断裂(变成线状),三种构型的质粒分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率是不一样的,因此会出现多条带,这也说明所得质粒不够理想。 测序结果的分析 构建好质粒之后我们一般先酶切鉴定,鉴定正确的可以直接拿去转染然后做WB检测表达即可。 可以正常表达的质粒我们需要送到测序公司测序,也可以直接送菌液测序,有些测序公司还提供质粒返还服务(即送菌液返还他们抽提的质粒)。 测序的引物一般使用通用引物,如果没有通用引物需要自行设计。常用的通用引物如下: |
|