【原】基因表达检测：RNA抽提

无逐 2020-04-11

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TRIzol法

试剂耗材准备：

RNase free的一次性带盖透明聚丙烯管（AXYGEN的EP管， RNase free的，拆包
即用）
RNase free的枪头（AXYGEN的RNase free的枪头，有盒装的和袋装的，拆包即
用）
RNase free玻璃瓶（玻璃瓶用锡箔纸包裹200°C烘烤2h，塑料瓶盖浸泡10min的0.5
M NaOH溶液，然后用RNase free水彻底冲洗）
RNase free金属器材（200°C烘烤2h）
氯仿（国产分析纯，比如国药集团产的）
异丙醇（国产分析纯）
RNase free水（DEPC treated水： 1）溶解RNA及配置试剂用Invitrogen AM9916；
2）冲洗用水自制，方法为：把去离子水加入RNase-free玻璃瓶中，加入0.1%
（v/v） DEPC用力摇匀， 37°C过夜，高温高压灭菌，灭菌时瓶口需拧松， DEPC受
高温会分解出大量CO2，注意安全！）
75%乙醇（无水乙醇溶于RNase free水中）
RNaseZap™ RNase Decontamination Solution， Invitrogen AM9780

样品准备：

细胞样品准备：
1）贴壁细胞：弃培养上清， 6 孔板 1 个孔（3.5mm）的细胞加 1ml TRIzol，室
温裂解 10min，用枪吹打，转移入 1.5ml RNase free EP 管。
2）悬浮细胞：离心沉淀细胞弃培养基，每 5-10×10⁶个细胞中加入 1ml TRIzol
吹打，室温裂解 10min。

组织样品准备：
1） 50-100mg 新鲜组织，立即装入 1.5ml EP 管，盖紧盖子，丢进液氮急冻。或
者用 RNAlater （Invitrogen AM7020）处理。
2）加 1ml TRIzol，冰上匀浆。
3）室温裂解 10min

注意：使用TRIzol试剂前避免洗涤组织和细胞，因为这增加了mRNA讲解的可能性。全程戴手套、口罩，穿防护服！必要时戴防护眼镜。

RNA抽提

1、氯仿抽提：每 1ml TRIzol 中加 200ul 氯仿，用手大力摇管 15s，室温孵育 2-3min
4°C 离心 12000 g×15min
P.S. 离心后，混合物分离为下层红色的有机相、中间相以及上层无色水相，RNA 存在于水相。

2、取水相：转移水相到新管
P.S. 转移水相时，枪尖随着液面下移而下移，避免扰乱分层，慢慢吸取，避免吸到中间相和下层有机相，更不要贪心吸太多，吸大约 400ul 就好。

3、异丙醇沉淀：加入 600ul 异丙醇上下颠倒混匀，室温孵育 10min
4°C 离心 12000 g×10min
P.S. 往往离心前 RNA 不可见，离心后在管侧面和底部形成白色沉淀

4、乙醇清洗：弃上清，加入 1ml 75%乙醇洗涤一次， 4°C 离心 7500 g×5min
P.S. 加入 75%乙醇时让 RNA 沉淀轻轻漂起来，或者保持原位，因为有时候RNA 太少，吹散了再离心下来时 RNA 碎片不一定能聚集到一起形成肉眼可见的沉淀，导致后面的“盲操作”。

5、晾干沉淀后溶解：尽量吸除上清，室温干燥 5-10min，以 DEPC treated 水溶解， -80°C 保存
P.S. 密切注意 RNA 沉淀的干燥程度，不要完全干燥，这将大大降低其溶解度。部分溶解的 RNA 其 A260/280 比值会偏低。最佳干燥度为 RNA 沉淀微微湿润呈啫喱状。

RNA质量检测

1、分光光度计测定

RNA 在 260nm 处有最大吸收峰，通过测定样品的 OD260、 OD280，可以估计样
品的含量和纯度。 OD260 为 1 的溶液含有 40ug/ml。
纯的 RNA 其 OD260/OD280 应为 2.0，如果比值偏小，则有机溶剂或蛋白污染较
严重。如果比值偏大，则 RNA 可能已发生降解。
以吸光度值估计 RNA 含量和纯度并不十分可靠。需要结合其他方法综合判断。

2、凝胶电泳法

配制 1.2%琼脂糖凝胶。将样品加上RNA loading buffer 后加入上样孔电泳。电泳液用新鲜的 1×TAE 即可。
紫外下拍照可以看见 3 条带，从上往下依次是 28s RNA、 18s RNA 和 5sRNA。其中 28s RNA 应为 18s RNA的 2 倍且没有涂抹状条带，这样的 RNA 质量是过关的。
吸光度测定法不能区分 DNA 和 RNA，而电泳法如果看到上样孔内亮亮的，那通常为污染的 DNA。如果 DNA 会干扰后续实验，可以用 DNase 消化去除。可以通过与 marker 比较估计 RNA 含量。

附RNA loading buffer 配方