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Trizol法使用步骤 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。 二、需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free） 三、准备工作 RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。 RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。 1、 塑料制品的处理 尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下： 1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。 2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 3）在通风柜中室温处理过夜。 4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。 5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 2、 璃玻和金属物品 250°C高压灭菌烘烤3小时以上。 四、从组织中提取总RNA步骤 1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。 （液氮既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。终止细胞内外一切生物反应，防止RNA酶的降解反应） 2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。 3) 加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。 4) 12,000rpm 离心5min，弃沉淀。 5) 按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。 （氯仿为有机溶剂，有效的使有机相和无机相迅速分离。有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和RNA脱离，RNA进入水相） 6) 4℃ 12,000g离心15min。 7) 吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。 8) 按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇（沉淀RNA）混匀，室温放置5-10min。 9) 4℃ 12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。 10) 按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇（沉淀RNA），温和振荡离心管，悬浮沉淀。 11) 4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。 12) 室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。 13) 可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。 （TE缓冲液由Tris和EDTA配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和RNA。用于酶切反应不能使用SDS） 14) 测O.D值定量RNA浓度。注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间； 电泳检测：1%琼脂糖，1×TEA缓冲液，90V电泳30min，凝胶成像系统观察，分析结果。 注：组织过少，可酌情减少Trizol用量；组织用量过多，会引起DNA对RNA的污染；热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源； 注明：本文整理自网络 |
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