分子生物学实验中,RNA的提取是非常关键的一步,决定了之后QPCR结果的质量
快跟小编一起学习一下RNA提取过程及注意事项吧! 关于RNA抽提有很多方法,其中TRIzol法是最常用的。我们常说的TRIzol其实是Invitrogen公司试剂的名称,其含有苯酚(phenol)、异硫氰酸胍(Guanidium-thiocyanate)等物质。其原理是:TRIzol中的成分使细胞裂解同时核蛋白体上的蛋白变性,核酸释放 加入氯仿后离心,样品分水样层和有机层,RNA位于水样层中,收集水样层,通过异丙醇沉淀将其还原,可得到纯净RNA 1.细胞除去培养基,PBS洗两遍,加入1mlTrizol,吹打混匀至无团状物,静止5-10min使细胞充分裂解(注意带好口罩手套防止交叉污染,枪头,EP管均使用不含RNA酶的进口枪头) 2.每EP管加入0.2ml氯仿,氯仿:Trizol=1:5(加入氯仿,苯酚等有机溶剂溶于氯仿,而RNA溶于水相) 3.上下颠倒15s(约36次),冰上静止10min(此时可预冷离心机4℃) 4.4℃,12000g,离心10min 5.小心的吸取水相,一般1mlTrizol吸400-500ul,建议吸取400ul,不要吸到中间层,影响RNA的纯度。 6.每管加入异丙醇,体积与上一步吸取水相体积相同,400ul,上下颠倒15s(约36次),冰上静止10min(异丙醇能夺取核酸周围的水分,使RNA聚集而发生沉淀) 7.4℃,12000g,离心10min 8.用移液枪弃去上清 9.加入1ml 75%DEPC酒精,手弹沉淀洗匀-----4℃,12000g,离心5-10min,弃去上清,重复2-3次(此步骤可洗去残留的异丙醇) 10.弃去上清,尽量吸干,开盖晾10min 11.加15-25ulDEPC水,根据沉淀的量加入,-80℃保存
因为生物体内部和外部环境中存在大量的RNase,并且RNase不易失活,高温下仍能正确的折叠恢复活性 所有实验所用的枪头、离心管等消耗品均要使用RNase-free的(一定注意!!!) 整个过程要在无RNase污染的条件下进行,通常可以在无菌操作台中进行实验,并用75%的酒精进行擦拭杀菌; 所有相关溶液的配制要使用RNase-free水或DEPC水 (包括75%酒精也需要用无水乙醇与DEPC水配制); 实验过程中一定要戴手套和口罩(可以避免实验过程中不打喷嚏) 异丙醇、氯仿、乙醇等试剂使用避免多次使用的交叉污染
今天的分享就到这啦,大家一定注意防止RNA酶的污染呀!祝大家实验顺利!
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