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我们在工作中时常遇到这种情况，千辛万苦取到了几个样本，兴高采烈地送去做测序，本以为很快就能拿到结果，结果辛辛苦苦抽提的RNA降解了。 今天小编带来满满的干货，RNA提取小课堂开课啦，我们就来聊一聊关于RNA抽提的那些事儿吧~希望对于正在进行实验的小伙伴们提供一些帮助，前排搬好小板凳，敲黑板划重点啦~ RNA是以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录形成的一条单链，主要功能是使遗传信息能够翻译成蛋白行使生物学功能，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。当我们研究基因的表达和调控时，第一步需要做的就是从组织或细胞中分离和纯化RNA。 1 首先了解一下RNA提取的几个小原则 1.保证RNA的完整性； 2.获得高纯度的RNA； 3.操作简便，稳定性强。 明确抽提RNA的使用目的 RNA用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。因此，明确实验目的是进行后续实验的首要条件。 Trizol法抽提 Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。 1.Trizol作用原理 在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。 2.标准Trizol提取步骤 液氮研磨--加入Trizol裂解混匀--加入氯仿抽提--离心--加入异丙醇沉淀--离心--酒精洗涤--离心--无酶水重溶。 3.具体实验步骤 （1）实验准备 RNase free的枪头、EP管、PBS、Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇、RNase free水； （2）样本处理 对取下的新鲜组织(50mg)用PBS快速清洗表面附着物，放入离心管，加入1ml Trizol匀浆。室温静置5min，4℃，12000 g，离心5min，吸取上层液体至新的离心管中； （3）氯仿萃取 按0.2 ml氯仿/1 ml Trizol的量加入预冷的氯仿，即200ul，上下振荡15s，室温孵育5min。4℃，12000 g，离心15 min。混合物分离为下层红色的酚-氯仿相、中间相以及上层无色水相，RNA存在于水相。 （4）转移水相 转移水相时，枪尖随着液面下移而下移，避免扰乱分层，慢慢吸取，避免吸到中间相和下层有机相，更不要贪心吸太多，吸大约400ul就好，转移至新离心管中。 （5）异丙醇沉淀 加入等体积预冷的异丙醇，混匀，静置10分钟后，4℃，12000g离心10min，弃上清。异丙醇主要用于沉淀RNA。 （6）乙醇洗涤 加入1ml预冷的75%乙醇，轻轻将整块沉淀吹起悬浮，此处千万注意别把RNA沉淀吹散，因为RNA吹散后很难通过离心重新聚集在一起，最终导致实验失败。4℃，12000 g，离心5 min。 （7）RNA溶解 尽量吸除上清，室温干燥3-5min，此处注意不要干燥过度否则会引起RNA难溶甚至降解，也不宜时间过短使酒精挥发不完全。加入30-50ul RNase free水（量视RNA提取量大小而定），充分溶解沉淀，保存于-80℃。 （8）RNA浓度检测和电泳评估RNA浓度和质量。 当然现在也有许多抽提RNA的试剂盒可供大家选择，操作相对更加简单，省时省力。 不同抽提方法优缺点
TIPS 最后，关于改善RNA提取质量的一些小建议也一并奉上，快快收到你的“碗”里吧。 1.使用正确的细胞或组织储存条件，在样品用液氮速冻后，应该储存在-80℃，样品在RNA提取之前应避免反复冻融。 2.研磨过程要迅速，彻底匀浆样品。 3.尽量使用无RNase的枪头、试管和溶液，手套也应经常更换；实验前移液器、工作台、玻璃器皿，最好用RNaseZap擦拭。 4.建议分装RNA溶液进行保存，避免反复冻融，导致RNA降解。 5.使用Rnase-free的双蒸去离子水或其他缓冲液溶解RNA，否则容易导致RNA降解。 6.结合组织样本本身的特点，选择最优的抽提方案。 综上所述，对大部分实验狗来说，RNA抽提比DNA抽提要相对困难一些。希望今天小编的分享能给你们的实验带来一点帮助~！ |
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