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但是跑小分子蛋白，浓缩胶的长度要再长一些，最起码要保证三分之一浓缩胶，三分之二的分离胶，浓缩胶多，可以保证不同分子量的蛋白充分压缩到同一起跑线。小编跑过的大分子蛋白是mTOR，理论上分子量289kDa，比起小分子蛋白，大分子蛋白还是很好跑的，但是实验室现有的彩虹marker最大只到180kDa，也问了很多厂家，发现适用于跑大分子量的marker... 阅1210 转3 评0 公众公开 19-02-27 09:02 |
WB图背景很脏怎么办？3. 制胶：玻璃板夹紧之后，我们会习惯性加水试一下是否漏胶，建议用蒸馏水而不是自来水测试，测试结束后要将玻璃板之间的水倒干净，用滤纸吸干残留的水；6. 孵育抗体：我们孵育一抗的时间大多会选择4度过夜，但是具体多长时间算合适，其实没有硬性规定，但是二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育两小时，并要清洗... 阅1 转自yjt2004us 公众公开 19-02-22 01:10 |
4. 重要的蛋白酶抑制剂：组织或细胞内通常含有大量的蛋白酶，在提取过程中这些蛋白酶被释放出来，有可能消化目的蛋白，因此抑制住这些蛋白酶的活性对于防止目的蛋白的降解极有帮助。不管是悬浮细胞，还是贴壁细胞，操作都是相同的：加完裂解液后，将细胞置于冰上（但不要冻住）使其充份裂解，然后再冰浴超声以打断DNA分子，取出少量以用于测定... 阅103 转1 评0 公众公开 19-01-10 17:55 |
① 第1类''''''''negative''''''''表示 的是不加任何荧光素偶联抗体时得到的荧光信号，即“blank”因为没有标记任何荧光素，所以这组得到的荧光信号与荧光素无关，与细胞抗原分子是否表达无关，得到的荧光信号代表的是非特异性荧光信号（当实验要求不高、已进行预实验或者能... 阅2 转自yjt2004us 公众公开 19-01-01 12:30 |
组织免疫荧光应该这么做？组织的免疫荧光之所以难做，是因为组织会有自发荧光，会干扰我们的实验，尤其想在组织上做磷酸化的免疫荧光那更是难上加难。这次主要讲组织的免疫荧光。所以，石蜡切片的片子需要做抗原修复，需要在柠檬酸盐缓冲液中煮30 min，这样更有效的去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，充分暴露石蜡切片样品中的抗原表位，... 阅1 转自yjt2004us 公众公开 19-01-01 12:28 |
加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。将细胞从37℃培养箱取出，用预温的PBS洗3遍，每次加入1ml PBS，轻轻晃动，避免将细胞冲掉。将PBS中的细胞取出，注意细胞面朝下，载玻片上滴入亮甲油，或者防防... 阅2 转自zhangbob2... 公众公开 18-12-21 20:26 |
免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合及细菌的Protein A或G特异性结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象，将靶蛋白从混合体系中沉淀下来。ELISA是将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。7二抗孵育完后，用PBST清洗3次，加入底物，避光孵育30min，用酶标仪检测OD值。5 用PBST... 阅1 转自国瑞的书 公众公开 18-12-21 20:24 |
具体讲免疫荧光的步骤，这周主要细胞相关的免疫荧光，涉及到贴壁细胞、悬浮细胞。6.1如果只是单纯的做爬片细胞的免疫荧光，可根据细胞不同决定固定的时间，比如我用的HeLa 229细胞，大概铺片4小时后开始贴壁，6-8小时完全贴好，贴壁后9-12小时可以传代一次。如果我做的是病毒，以A549细胞为例，A549细胞的细胞周期与HeLa229细胞周期也不一样。... 阅2 转自yjt2004us 公众公开 18-12-21 20:24 |
在抽提蛋白时，要在裂解液中添加蛋白酶抑制剂，如果检测的磷酸化蛋白，则要在裂解液中添加磷酸化酶抑制剂，并且要在冰上操作，避免蛋白降解。选择合适的胶浓度并胶要配均匀（PAGE胶浓度的分离范围如下表）。现在常用的膜有PVDF膜或NC膜。NC膜同样具有高灵敏度和低背景的特点，但干的NC膜较脆，无溶剂耐受性，使用前用缓冲液湿润即可。孔径0.45u... 阅116 转1 评0 公众公开 18-09-11 15:38 |
我常用的是1.5mm的板，最开始配胶的时候把握不住分离胶加到什么位置，导致浓缩胶不是太长就是太短，当夹板顶在透明架子最下方就是3号线的位置时，分离胶加到2号线的位置大概6.8ml左右的样子就可以啦，这样1号和2号线中间浓缩胶长度刚刚好。配好的可以第一天配好胶包保鲜膜放4°，这样第二天时间比较充裕。然后，摆好条带，对折杂交膜，将两... 阅269 转4 评0 公众公开 18-09-09 14:35 |
