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Western blot真的是让人头疼的实验，辛苦付出和完美结果不成正比的实验，是整个研究生阶段最磨练我个人忍耐力的实验，要掌握整体操作并不难，但是需要注意的细节却很多，而且，三分靠努力，七分靠运气，当你把能做的都做了的时候，能修改的条件都修改了，结果仍然是空白条带，what can I do for you? 今天，小编给大家简单整理一下，自己在跑小分子蛋白和大分子蛋白时，摸索出来的经验和条件，欢迎大家积极讨论分享。 一、小分子蛋白 小编当时在跑S100A4，分子量12kDa。首先，要注意的一点就是，小分子蛋白很容易在提取的过程中降解，所以整个操作过程一定要保证在冰上低温快速充分的研磨提取，具体的裂解组织的步骤我就不说了，不过说到组织，小编想提一句，组织提蛋白有一点需要注意，就是这个蛋白在组织中的表达丰度、以及蛋白定位。胞浆或者核内的蛋白提取方式会有不同，细胞核内的蛋白可能需要特殊的裂解液，一是通过阅读文献，清楚相同的蛋白和组织，别人的跑出来的情况如何；二是可以通过在The Human Protein Atlas网站（不懂看这个（工具篇）S5E50：航母级神器——蛋白组学结果大收录！）上查询。1、 电泳条件：a) 小分子的蛋白电泳建议选择15%分离胶，5%浓缩胶。正常配胶时，一个迷你垂直电泳仪的配制，5ml分离胶，2ml浓缩胶，跑正常分子量的蛋白是没有问题的。但是跑小分子蛋白，浓缩胶的长度要再长一些，最起码要保证三分之一浓缩胶，三分之二的分离胶，浓缩胶多，可以保证不同分子量的蛋白充分压缩到同一起跑线。b) 电泳时间：浓缩胶80V，300mA 50min,分离胶120V，300mA1h10min，分离胶时间不建议太长，只要把marker跑开，能够区分开内参和小分子蛋白就好了。我的习惯是电泳的全程也会把机器放到冰水混合物中，防止温度过高，蛋白弥散。c) 蛋白上样量：正常分子量蛋白30ug足够，可以建议小分子量蛋白先用二倍的量60ug试一下看看。2、转膜条件：a) 小分子蛋白很容易转过，所以摸索适合自己蛋白的转膜条件很重要，这一步很难说一次就成功，所以刚开始的时候可以在接触胶面的PVDF膜上再放一张PVDF膜，转膜结束后，立春红染色，观察使用的条件是否会转过头。b) 转膜液中一定不要加SDS，因为SDS会结合小分子蛋白的抗原位点（这一步解释不知道理解的对不对）。c) 我们实验室正常的转膜条件是220V，300mA，湿转1h30min，但是这个转膜条件对于12kDa分子量的蛋白完全会转过头。转膜条件上，我也摸索了很久，问过身边跑小分子蛋白的同学，也咨询过抗体厂家的技术支持，100V恒压，或者200mA恒流，40-60min，都可以跑出来结果，同时也可以保证内参的效果很好。d) 之前看专业网站里有人分享的经验，用0.2%的戊二醛固定，没有尝试过，不明白其中的原理，不明觉厉啊。e) 有人建议过小分子的蛋白转膜时用0.2um PVDF膜，我也尝试过，但是效果并没有0.45 um PVDF膜好，关键点还是在浓缩胶长度和转膜电压电流的条件上。f) 很多小分子的蛋白属于分泌型蛋白，建议这种情况用ELISA试剂盒检测，虽然贵，但是一次就出结果啊，时间才是金钱。3、抗体选择和发光：a) 本人用的都是国产抗体，所以抗体浓度都特别高。说明书要求是：1:500-1:2000，但是我用的是1:300的浓度比，其实这样也挺浪费抗体的，一瓶抗体50ul，等我把条件摸索出来，一瓶也用光了，有条件的同学还是建议买进口的吧。b) 小分子蛋白发光的时候，机器很容易显示出信号弱，让你自动发光改成手动发光。遇到这种情况的时候，你可以试一下选择曝光时间30sec-1min，短时间曝光，曝光强度大，也许一次就发出来了。二、大分子蛋白小编跑过的大分子蛋白是mTOR，理论上分子量289kDa，比起小分子蛋白，大分子蛋白还是很好跑的，但是实验室现有的彩虹marker最大只到180kDa，也问了很多厂家，发现适用于跑大分子量的marker并不是很多，所以在跑大分子量蛋白的时候，浓缩胶以下到130kDa之间的部分我都会留下。1、电泳条件：a) 选用5%浓缩胶，8%分离胶，浓缩胶80V，300mA 40min，分离胶120V，300mA 3h就可以了。同样的，电泳全程也需要在冰水混合物中进行，我觉得保持低温的效果会更好。b) 大分子蛋白的上样量不需要太多，30ug就足够了，小编之前试过60ug的上样量，其他条件都没有变，但是发出来反而的空白条带。这一点我也解释不清楚，针对大分子量来说，上样量多的话，蛋白抗原位点和抗体的结合的比例可能就需要重新调整了吧。2、转膜条件：a) 转膜时间要适当延长，220V，300mA，湿转，建议时间在2h30min-3h，因为转膜时间很长，所以一定要提前准备好足够的冰袋降温。b) 转膜液中可以加入一些SDS，具体的量我并没有认真计算过，只是按照电泳液配制量，用200ml甲醇溶解，然后再加入800ml蒸馏水补齐。对于大分子量蛋白加入SDS是为了增加了蛋白表面电荷，从而增加转膜效率。最后，想提醒大家的一点是，大分子蛋白和小分子蛋白最好单独跑，不要和其他分子量的蛋白一起跑，不要为了节省样本，一板胶全都利用上，经验和教训告诉我，这样做只可能全都瞎了，做实验就像是过日子，该省的省，该花的花！ |
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