【原】如何优雅地获得漂亮小分子蛋白条带

作者：阿甘

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做过Western-Blot的童鞋知道，分子量小于30KDa的蛋白分子不容易做。做为一只电泳狗，我被小分子蛋白折磨的是遍体鳞伤。小分子蛋白虐我千百遍，我待小分子蛋白如初恋。抱怨是没用的，想方设法解决问题才是王道。

一次又一次的调整方案，一次又一次的徒劳无功。正当我感到绝望之时，正当老板对我叹息失望之时，我的小分子蛋白结果出来了。从此以后，我的小分子蛋白之路顺利许多。在此，我总结了我的小分子蛋白之路经验，供有需求的童鞋参考。

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提蛋白的过程在30分钟之内完成，提完蛋白立即加入上样缓冲液煮沸（煮沸的时间长一点，一般20分钟），准备好蛋白样品后立即电泳。（小分子蛋白容易形成多聚体，这样可以大大减少多聚体的形成）。

2

电泳时，电泳的时间要足够长。我的习惯是先用60-80V电压跑完浓缩胶，再以100-120V电压跑分离胶，溴酚蓝电泳至玻璃板底部。伯乐系列的电泳槽一般电泳2个小时左右，GE以及百晶系列的电泳槽要电泳4到5个小时。电泳时要在冰水浴中进行。最好用1mm和1.5mm厚的胶（若用0.75mm厚的胶时要适当缩短转膜时间）。

3

转膜时，尽量用湿转法（半干转也可以，但是容易转过）。转膜缓冲液中，甲醇浓度要达到20%。PVDF膜，财大气粗的土豪可以用0.22微米的膜。对于我们大多数穷人来说，0.45微米的膜也是可以的。以下是我摸索出来的转膜时间（湿转法，0.45微米的膜），供大家参考。

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一抗孵育 因为多数小分子蛋白的表达量较少，所以我一般孵育至少48个小时，甚至孵育72个小时。

以上方法适用于分子量在20-30KDa的蛋白。若蛋白分子量小于15KDa，则不用SDS-PAGE凝胶电泳（蛋白与SDS共迁移，影响分离度，得不到很好的分离效果），应该采用Tris-Tricine缓冲系统与Tricine分离胶。具体操作步骤见《精编分子生物学实验室指南》338-340页（这本书每个实验室必备，若没有，可以在孔夫子旧书市场上买一本）。

需要注意的是，Tricine电泳时，蛋白样品用Tricine样品缓冲液处理，加样前在37-40℃沙浴中处理一个小时（不要煮沸！不要煮沸！不要煮沸！重要的事情说三遍）。内槽中加满阴极缓冲液，外槽中加满阳极缓冲液（千万不要加反了。否则蛋白全部进入缓冲液！）。

 最后，祝做小分子蛋白的童鞋实验之路顺利，早日做出满意的结果。