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继上次推出的彩蛋活动中介绍的内参和二抗的选择方案的文章后，好多小伙伴私信小编，让小编整理出一些关于WB的实验干货。。 excuse me？ 让我扶墙站会er 。。。。。 想当年，小编做科研狗的时候，刚开始接触WB也是一头雾水，跟着实验室的师兄师姐身后转悠打下手，然后就是在坛子里面来回看，感觉都快看出个花来，但是，对自己并没有太大的作用，很多都是别人的实验问题，跟自己的实际情况好像搭不上边。。。 于是，开始走上自我探索的科（bu）研（gui）路。 下面，是小编根据ABclonal公司多年的国外研发团队的实战经验+ABclonal忠实粉丝的一线奋战经验含泪整理出的WB实验宝典，当然还有一些经验来自小编自己的辛酸泪。 Anyway，看到这里，大家有木有一丝丝感动？！？本宝典分为上下两篇，今天将给大家介绍一下我们在WB实验步骤中的干货知识，话不多说，上菜！！ WB实验专题（上篇） WB（Western Blot）即蛋白印迹法，其原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 蛋白免疫印迹一般由样本处理、凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测组成。 WB中检测样本来源主要是细胞、组织、微生物、植物等蛋白样本；在WB检测中，样本中蛋白提取的是否充分，在整个WB检测中非常的重要。样品提取的方法常见的为机械法、物理法和化学及生物化学方法。 A：机械法 * 高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎； * 玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小； B：物理法 反复冻融法、冷热变替法、超声波法、加压破碎法； C：化学及生物化学方法 * 有机溶媒法、自溶法、酶法、表面活性剂处理； * 样本经过处理后，使样本中的蛋白能够解离出来，用于后续的检测； * 现在用的较多的是提取方法是以上几种方法联用，最常规的就是RIPA裂解液。其中根据蛋白性质的不同，我们选择的裂解液也不一样。 裂解液的比较： 1、用于普通的Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液，裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。 2、对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。 3、对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。 tips：曾有同学抱怨购买我们组蛋白修饰的抗体试剂盒，但检测的信号太弱了。后来得知该同学是RIPA buffer裂解细胞后离心收集上清再加入loading buffer制备样品，殊不知像组蛋白这类水溶性很差且与DNA结合紧密的蛋白，需要超声处理裂解细胞，如果只是收集上清往往可能造成很大的损失哦！ 样品制备完，应立即低温保存（-20℃短期（几天））；-80℃长期；例外，IP用样品应直接进行IP，避免冻融破坏蛋白质间的相互作用。在样品制备过程中，另一个需要注意的问题是，从样品制备的起始阶段就要注意定量问题；WB本身系统误差有20%，太细微的差别经常忽略不计。细胞样品可以先计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对WB结果影响太多。组织样品，从肿瘤组织的大小（称重）开始，裂解液的体积都是精确定量的，操作过程也尽量避免蛋白损失。 基本原理：凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.8，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.8。 tips：制胶过程中，切记胶一定要平，凝胶的速度不能过快，当然购买预制胶的土豪可以直接忽略。。 电泳时，点样顺序需要提前做好设计，空的泳道需要点上等体积的1X loading buffer。通常是恒压电泳，具体电压根据各自仪器的不同而略有差异，但不要太高。样品间浓度差异过大、盐浓度过高、太过粘稠、有不溶的颗粒物、胶孔不齐等是条带不够美观的主要因素，大家尽量避免。 在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，蛋白分子量在15kD～200 KD的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系。 根据蛋白分子量大小的不同，选择不同浓度的分离胶用于实验。 tips：8%胶最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa。8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白，转膜效率对WB结果的的影响都问题不大。12%，180KDa左右，转膜效率对WB结果的影响都问题不大。对于大蛋白转印，很多书本建议采用低浓度胶，如6%SDS-PAGE。但实际操作发现，6%太软，制作转印三明治的操作非常麻烦；且内参如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%胶底边溴酚蓝指示55KDa左右，除非采用一些论坛上有人提过的灌注不同浓度的胶或梯度胶，否则需要同时跑两块胶，因此也不是很推荐。小编经验认为300KDa以下8%胶（底边36KDa）都可以胜任，可以适当调整选择7-8%胶同时可以兼顾内参和大蛋白。 基本原理：SDS-PAGE凝胶中的蛋白带有SDS负电，在电场的作用下，带负电的蛋白会转移到膜上。即，把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜（NC 膜）和聚偏二氟乙烯（PVDF 膜），蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳）。 方法选择：半干转法or湿转法？ 转膜方法一般有半干转法和湿转法。两者原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转适合所有的蛋白，转膜效率最佳，但靡费试剂、溶液，对普通分子量大小的蛋白转染操作时间长于半干转（下文会具体给出条件）；半干转适合分子量较小的蛋白，省时、省试剂。蛋白分子大小如何界定呢？习惯上认为100KDa以上为大蛋白，其他均属于小蛋白，当然这只是一个相对标准。因此，通常对大蛋白的转印多数人会选择长时程的湿转。 有必要指出的是，实际上用半干转缓冲液进行湿转效果也非常理想，通常这种缓冲液可以反复使用多次（<=5次常规1hr电转，如有3hrs长时程转染，缓冲液使用次数会减少），不过要注意初始电流（同样温度下，初始电流高，表明缓冲液中电解质剩余不多，为确保转膜温度，可开始或中途更换新鲜转膜液）。电转液中SDS增加蛋白的水溶性，促进蛋白在电转液中泳动。若不加SDS，蛋白会沉淀在胶上，但SDS过多会影响蛋白与膜的吸附。甲醇能使SDS与蛋白分离，甲醇浓度越高SDS与蛋白分离越快，但高浓度的甲醇对蛋白会有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。一般来说甲醇的浓度为20%，但PVDF膜截留marker上交联的小分子颜料的能力很差，可考虑提升甲醇的浓度至25%（它对普通蛋白的转膜影响不太，颜料截留更多）；大蛋白转印可考虑降低甲醇浓度。甲醇的另一个作用是降温，旧的电转液由于电解质的消耗和甲醇的挥发，电转时电流或电压变化更快、温度升高也更快，因此可考虑增加额外的甲醇；这点对半干转缓冲液的意义较大，因为半干转缓冲液消耗很慢，缓冲液放置的时间较久，甲醇挥发比较严重，可临时少量补加。 tips：转膜缓冲液的配制方法：39mMglycine2.9g, 48mMtris5.8g, SDS0.37g加入600ml去离子水，充分搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至800ml后，加入200ml甲醇，室温保存。有时，未将低昂地实验毒性，也可以将甲醇替换成乙醇，对实验的影响不大。 转膜温度： 转膜最好在低温进行（高温会局部溶胶或降低转膜效率），尽管很多半干转仪没有具体要求，但用预冷过的电转液湿滤纸比未预冷的转印效率更高。因此，有条件建议湿转、半干转均在低温（4℃）进行。此外，湿转缓冲液可以考虑转印前-20℃预冷，时间不能长于2hrs，否则电泳液冻结。 转膜三明治的制作： 制作转膜三明治的过程中，书中强调过滤纸、胶、膜的大小最好一致，否则没有胶、膜隔开部分的滤纸会因为直接接触而产生局部短路，降低内阻增加电（压）流，造成升温过快。但进口仪器随厂原包装附带的滤纸有限，如果每次都切割新滤纸，消耗过快、初次使用的膜转膜效率不高，且增加额外的操作。因此，实际上滤纸大一些也不太要紧，但是小编会选择已经切割好的和胶面积最接近的滤纸；通常膜的大小会严格控制在与胶面积一致或略小一点点。操作时在保证每一层均无气泡的前提下，叠好后再碾压几个来回，力道要均匀、恰好；力量过大，胶会被拉伸，条带会扭曲、变形。碾压的目的不是为了驱赶气泡（完全可以做到叠加的时候每一层都无任何气泡；诸如采用多层薄滤纸时可以一张张的叠加），更重要的作用是让膜和胶贴得更紧密。可以理解的是，对于蛋白分子的大小而言，胶和膜之间的间距是数十万倍计的，因此更紧密的接触无疑是转膜成败的关键。 tips：在ABclonal的实验体系下，恒流（不低于200mA）转40-200min（分子量大的目的蛋白需要更更高的电流和更长的时间）能满足各种大小蛋白的实验需要。半干转虽然速度快，但效果是不如湿转的。观察预染marker、转膜后考染检测凝胶可以帮你判断转膜效果。如果担心转过，0.2μm孔径的膜是你最好的归宿。转膜会大量放热，注意保持低温；转膜槽连续使用会有大量盐在电极丝上析出，建议使用后用纯水浸泡已维持正常的使用效果；细心、无气泡是转膜的基本素质，只能帮你到这啦。   半干转法装置 湿转装置 在转膜过程中，膜的选择非常重要。现在常用的膜有硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。 硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜： NC膜与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但小分子蛋白与NC膜结合力较差，洗涤时易丢失，同时NC膜韧性较差，易损坏； 聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜： 与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。 tips：实验的注意事项 1．聚丙烯酰胺的30%母液会降解，要4℃避光保存。 2．APS会失效，10%APS一般保质期才一个月左右。-20℃分装长期保存。 3．注意Tris buffer的PH值，以及平时所用的水的PH值。PH值改变会使带型非常怪异，所有蛋白和溴酚 蓝压成一条细线（即便在分离胶中），如果溴酚蓝前有红色染料，那么此染料彗星式拖尾从溴酚蓝一直延伸到胶底部（溴酚蓝此时涌动极缓慢，位于胶中上部）。 4．上下层式电泳装置若漏液，哪边漏液，电泳条带往哪边倾斜。内外式电泳装置漏液，则装置处于短路状态，液体会过热。SDS-PAGE胶可能局部自溶，条带扭曲、变形。 5．配胶用玻璃板和边条应及时洗净。 玻板未洗净的坏处很多。尽管玻璃看似平滑，但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒 （摸上去疙疙瘩瘩），其坏处是，在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。如果是RNA的超薄胶，胶板的颗粒会导致局部巨大气泡，非常难于清除；蛋白胶也会导致一些小气泡的产生。玻板没洗净的另一个坏处是，由中学物理知识可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会削弱和胶体间的粘附力，拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部出现大量气泡（夹在玻板和胶之间，这个关系不大）；严重的错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光，或者甚至胶和玻板分开。为避免拔梳子时的错动，可在电泳缓冲液中拔梳子（比水更好，有SDS润滑）。判断玻板是否洗干净，用手摸一下有没有疙疙瘩瘩的；最好用洗洁精之类，洗衣粉、肥皂都不好用。 6．上样时，不要把tip深入胶孔过深（或者采用细的尖端拉长的专用上样枪头），可能会错开胶和玻板， 样品会泄露。 7． 增加上样量不一定会提高荧光信号强度。 增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幂量级的，所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集（可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰）。增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。 以6孔板80%以上汇合度为例，细胞裂解液通常都是投入200ul（最少80ul，这样面积 的培养板如果裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到一致），而这种浓度条件下制备的样品，电泳时上样量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul时内参基本已经开始粘连成一条线，带型出现波浪纹；当然并非不可以多上样，再多对WB最终的结果影响不大（没有的仍然没有），且条带都很丑。 8. SDSPAGE胶配好暂时不用时，需用电泳缓冲液灌满空间（拔去梳子和底边边条后的间隙），用保鲜膜包裹防止液体蒸发，短期室温或稍长期4℃保存。个人习惯为，灌好分离胶用饱和的正丁醇灌满上层，保鲜膜包裹，次日再灌堆积胶。两种方案都可以。所以如果预计次日工作量较大，可以提前灌好SDS PAGE。 如何监控转膜的效率呢？ 最先考虑的应该是立春红染色，来发现此操作不仅增加额外的操作时间，而且不能说明任何问题，于是抛弃之。 首先，立春红（也包括考染胶）的灵敏度和HRP-ECL体系的灵敏度相差太远，即使立春红染膜无颜色，也无法提示WB结果会不会失败（考染胶无颜色也不能说明转膜充分了，除非你银染），你仍然得继续后面的操作；相反靶蛋白区域有颜色，亦无法提示靶蛋白就转膜完全了，也许只是另外一个分子量大小相近的蛋白。因此，无论立春红染膜失败或成功，你都必须进行后续的操作。而立春红染胶不仅增加额外的操作时间，而且增加一轮漂洗的操作，对膜和膜上的蛋白都不好。那么为什么不采用更直观的预染marker做转膜监控的依据呢？理论上，同时转膜、颜色是交联到蛋白上的，因此颜色有多深表明有多少蛋白转印到膜上，非常直观、不会增加任何额外的操作（固定marker的上样量非常必要）。当然上面提到针对PVDF膜，由于对小分子截留的局限，颜料分子会在高强度的转印过程中从交联的蛋白上脱落并穿过膜（颜料与蛋白交联得过深会使整个lane糊掉；太紧（多）可改变蛋白构象使迁移率改变。所以多数情况下颜料和蛋白之间是一种不稳定的交联，这意味着在某些条件下，颜料会从交联的蛋白上脱落，又因为膜分子孔径以及膜对不同物质吸附能力的差异，颜料小分子会轻易穿过膜到滤纸背面，而蛋白则被牢固的截留在膜上），造成转膜过度的假象。现在你知道有这种局限，要么更换NC膜；要么采用上面提到的非常稳定的转膜条件、注意必要的细节，就可从根本上忽略掉其对转膜效率的指示，而把预染的marker仅仅作为一个分子量大小的指针，当然同时可确认之前的转膜操作无误（没有插反电极，放反膜），也可为后续抗体孵育操作时膜的正反面做必要的提示。 不同公司预染的marker效果不太相同，一般NEB和invitrogen的常规分子量预染marker要上8-10ul，MBI的只要5ul（胶大小20×30cm），Biorad－mini3型（8.2×7.4cm)MBI最低2.5ul转膜后就足够清晰。 基本原理：利用抗原和抗体的特异性反应，检测目的蛋白；免疫检测方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X 光底片上曝光的条带来显示抗原的存在。 A 封闭： 将转印膜取出，用去离子水清洗，TBST洗一次5 min后，加入3%的脱脂牛奶封闭，于室温封闭1-1.5小时。洗膜1次，10 min； B 一抗孵育： 一抗（3%脱脂牛奶抗体稀释液），4℃孵育过夜。洗膜3次，每次10 min； C 二抗孵育： 二抗浓度（3%脱脂牛奶抗体稀释液），室温孵育1-1.5h。洗膜3次，每次10 min。一般用的二抗都是HRP（辣根过氧化酶）标记的； D 显影： WB检测中显影的常用方法根据催化底物不同，可以分为化学发光法和底物显色法；在WB检测中，常用的酶是HRP（辣根过氧化酶）和AP（碱性磷酸酶）。其中用的较多的是HRP。选用不同底物，出现的结果也不一样。
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来自： 风雨都停了 > 《western blot》
