实验技术3 Western Blot实验原理及问题全全全方面解决

      若有雷同？太刺激了！

一、实验简介
 1. 蛋白质免疫印迹（Western Blot）是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测特定样品，或提取特定样品，或提取物种某种特定蛋白的方法。通过凝胶电泳按照分子量大小分离蛋白，再利用特异性抗体识别这些蛋白的技术。
 2. 检测指标
       样品是否表达某种蛋白；蛋白表达量有多少；蛋白有多大；蛋白时空变化；蛋白修饰鉴定等。

二、理想的实验结果
        条带清楚、无背景；正确的分子质量；没有非特异条带；重复性好。内参过曝个人觉得不太美观，且有误差，如下图β-actin内参。老鼠样品不太容易跑齐就睁一只眼闭一只眼了。

        而下图可以明显看出趋势，且内参几乎相同（自卖自夸一波）。

三、实验流程及基本原理

       所有环节都很重要，但经验来说选择好的抗体是成功的一半。哪怕中间有环节不规范，也会跑得说得过去。

1. 靶点蛋白基本信息确认
（1）蛋白定位：组织定位、亚细胞定位、靶点蛋白定位对WB影响

   ① 组织定位：Uniprot KB网站，搜索靶蛋白，左侧expression项可看到组织表达情况，找到有靶标蛋白表达的的组织。

   ② 亚细胞定位：细胞膜、细胞质、细胞核等表达。

   ③ 靶点蛋白定位

       分泌性蛋白：培养细胞时可加入BFA（Brefeldin A）抑制分泌或检测细胞上清。BFA有助于阻止分泌性蛋白分泌到胞外。

（2）蛋白表达：不同组织细胞表达不同、需要诱导处理

   ① 选择靶标蛋白有表达的组织或细胞样品；

   ② 刺激处理，提高靶标蛋白表达。必要时可用药物、小分子诱导细胞，确保靶标蛋白易于检测。

（3）蛋白修饰：翻译后修饰的类型、靶点蛋白修饰对WB影响

       蛋白表达后通常需不同的翻译后修饰（如磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等）发挥功能，修饰受修饰酶/去修饰酶严格调控，使得在特定瞬间或时期细胞中蛋白持续稳定或动态变化。

       翻译后修饰可能导致检测到条带大小与预测不符，或出现多条条带（要与大蛋白降解区分）。部分修饰（如糖基化修饰）会出现弥散情况，加入去糖基化试剂可优化影响；磷酸化修饰需加入磷酸酶抑制剂，抑制了磷酸酶降解目标蛋白。
（4）蛋白稳定性：大蛋白降解后出现多个小条带。需选择对应蛋白酶抑制剂。
（5）靶点蛋白异构体：多个异构体产生多条条带，且不一定在所有组织都表达。

 2. 样品制备

 （1）标准流程：样品准备（细胞/组织）→裂解液→旋转（4℃ 45 min）→超声（冰上，功率40 kW，开始3 s，停止10 s，0-15次）→离心（15000-17000 g，10 min）→测蛋白浓度→分装保存（25 μl-100 μl，-80℃分装保存）

* 注意事项：
 ① 选择合适的裂解方法和裂解液，如表1；RIPA buffer配方，如表2；

表1  各部分推荐的裂解液

表2  100 ml RIPA buffer体系

 ② 裂解液中添加符合蛋白酶抑制剂；
 ③ 检测蛋白修饰，需加入去修饰酶抑制剂；
 ④ 超声破碎更容易富集。

（2）本实验室简化流程：样品准备（细胞/组织，样品间应保持数量相对一致）→蛋白loading裂解细胞→超声（变性后不黏稠可省略）→变性（98℃，10 min）→离心（12000 g，2 min）→-80℃分装保存

* 注意事项：

       样品收集后调成相同量，或凭经验根据细胞量加入等比例的蛋白loading可以很快调齐内参（测蛋白浓度，测了也不一定齐，浪费那时间干啥）。一般六孔板加入150-200 μl 蛋白loading，表达量低可加入50 μl 蛋白loading。其他皿等体积增减。蛋白loading配方及各成分作用如表3。

表3  50 ml 5×蛋白loading体系

 3. 制胶

       根据蛋白大小选择合适电泳胶浓度，确保不同蛋白迁移速率与分离程度最优。同张膜检测大分子和小分子蛋白建议使用梯度分离胶（先倒高浓度胶分离小蛋白，再倒低浓度胶分离大蛋白）。

       本人经验15 KD左右使用15%蛋白胶，15-100 KD使用10%蛋白胶，100 KD以上使用8%蛋白胶即可。配方如表4，作用如表5。
       原理：分子筛效应。肽链越长，迁移速率越慢，需要用越稀的胶。

表4  蛋白胶配方

表5  蛋白胶各成分作用

* 注意事项：

       APS放室温或4℃太久会发现胶凝固不好，甚至不凝。千万别偷懒，一个APS分分钟配完。

 4. 电泳：80 V恒压，20 min，待跑到分离胶可使用125 V至需要位置停止

       小蛋白较快通过凝胶，向阳极移动。大蛋白相反。电泳缓冲液配方及各成分作用如表6。

表6  10×电泳缓冲液配方及各成分作用

* 注意事项：

       玻璃板要洗干净，拔梳子要双手同时拔，最好注射器清理梳孔中碎胶，放置条带扭曲。

       不一定要等溴酚蓝跑到最下面。通过Marker看到目的蛋白对应的条带上下分开即可。过长会导致条带过宽，不美观。

       据B站很火的光头大哥说开始用20 V先跑10 min可以让溶液中离子跑出样品，减少离子对样品的影响。

 5. 转膜：250 mA恒流

       可根据蛋白大小调整转膜时间。本人经验15 KD转30-60 min即可，30-100 KD转120 min，180 KD左右大小转150 min，260 KD-300 KD转180 min也可以成功。转膜缓冲配方及各成分作用如表7。

       NC膜全称硝酸纤维素膜，带负电荷的蛋白质可以与膜发生疏水作用而结合到一起，价格便宜，韧性差易碎，但易于封闭非特异性结合。本实验室使用NC膜，之后的经验为使用NC膜经验；PVDF膜全称聚偏二氟乙烯膜，使用前需用无水甲醇活化（活化膜表面的正电基团），也有说由于PVDF膜有疏水性，不能和蛋白质结合，而甲醇可以赋予其亲水性。PVDF膜易于吸附蛋白质，价格贵，韧性强，适合小分子量蛋白电转印。

表7  10×转膜缓冲液配方及各成分作用

       1×缓冲液还要包含500 μl SDS（带着蛋白移动，阻止大蛋白沉淀，但抑制蛋白与膜结合）与10%甲醇（移除SDS，尤其小分子蛋白，防止蛋白转过或转不上膜）。

* 注意事项：

       PVDF膜要在甲醇激活完成后充分清洗，去掉残留甲醇；

       原则上分子量较小蛋白加入20%甲醇，缓冲液不加入SDS（不改也能压出来）。若用PVDF膜则使用0.22 μm孔径的 ；

       分子量较大蛋白降低甲醇比例（经验来说不加不太行，不降低很多蛋白也可以压的出），1000 ml 1×缓冲液中加入1 ml SDS，PVDF膜使用0.45 μm孔径。实验室NC膜就很好用，感觉没有转不上的蛋白。
       转膜前确认胶膜之间无气泡。

 6. 封闭+抗体孵育

       本实验室使用的NC膜，且一抗加入牛奶中，经验来看封闭没卵用（PVDF膜或使用抗体稀释液可能不一样）。主要因为实战经验，一抗中加入的牛奶或BSA本身有封闭作用，且现代抗体工艺越来越成熟，质量很高。不封闭条带一般没有太大背景（不信你试试）。
       一抗溶液配置：将抗体加入5%脱脂奶粉+PBST/TBST（Tween-20 0.05％）溶解，或5% BSA+PBST/TBST（Tween-20 0.1％）溶解。牛奶封闭效果较好，一些磷酸化修饰抗体由于牛奶中含磷酸酶，需用5% BSA封闭。实验室专用牛奶会去掉磷酸酶，可以直接使用，但市面购买的脱脂牛奶就要考虑一下了。
      一抗/二抗：摇床震荡，室温2小时或4℃过夜。抗体不要重复利用太多次，抗体稀释比例参照各抗体说明书。发现信号弱首先在一抗找原因，二抗影响较小。

       洗涤：PBST/TBST，10 min/次，3次。经验方法：第一次先涮一涮，第二次洗25 min，第三次洗5 min，也可达到效果，减少时间浪费。

* 注意事项：
 ① 决定WB是否成功，抗体因素最关键。好的抗体你会发现怎么跑都很好看，哪怕磷酸化抗体用牛奶上都几乎可以看到很足的信号。如果效果不好，使用5% BSA溶解抗体后，加入磷酸酶抑制剂效果较佳；
 ② 配置后要混匀，推荐不要放置超过四天。-20℃保存溶好的抗体短时间内可解冻使用，超过两周就不一定可以压出条带了。
 ③ 将膜放入塑封膜并用封口膜压紧，可大大节省抗体用量。二抗价格相对低廉可放在抗体盒中。
  ④ PBST与TBST洗膜区别：因为PBST中有磷酸基团，不适合洗含磷酸化修饰蛋白的膜。TBST成分简单，只有Tris和NaCl，容易配置，且实践证明不调pH没有很大差异，但溶液容易长菌。故可以全部使用TBST清洗。具体配方到处都有这里不详细说明。如果清洗后背景高可提高去垢剂tween-20浓度，使用0.5%。

 7. 内参选择

       胞浆和全细胞蛋白：GAPDH（37 KD），β-actin（43 KD），Tubulin（55 KD）

       胞核蛋白：PCNA（29 KD），Histone H3（17 KD）

       核膜蛋白：lamin B（66 KD）

       线粒体蛋白：COX IV（17 KD），VDAC1（30 KD）   

 8. 检测
       二抗带有HRP（辣根过氧化物酶）标记。在显影液（ECL底物）中，含有过氧化氢和鲁米诺（及其衍生物）在HRP的作用下发出荧光。
* 注意事项：
 ① 显影液现用现配，避光。若过曝可尝试稀释显影液。
 ② 底物应全覆盖。

四、WB常见实验问题
      信号弱或无信号；条带大小与预期不符；非特异条带；背景问题；内参问题；信号饱和度问题；蛋白转印问题。
 1. 信号弱或无信号：整体流程都可能
（1）信息确认及样品制备
       组织细胞中靶蛋白含量低：① 选择高表达样本，② 增加上样量，③ 放大信号（分离细胞响应组分，并用对应组分内参、使用相应裂解液、诱导靶标蛋白表达、选择确定靶标蛋白作为阳参）。
       修饰后蛋白靶标含量低：① 加入去修饰酶抑制剂，② 增加上样量，③ 阳性对照。
       分泌型蛋白：① 使用BFA抑制蛋白分泌，提取全细胞裂解液，② 提取培养上清的蛋白。
       裂解不充分：① 更换裂解液，② 提高SDS浓度，③ 裂解后超声破碎，特别是核蛋白。

（2）转膜
       abcam推荐丽春红染色检测转膜效果。个人感觉不需要，通过Marker模糊程度就可以粗略判断转膜是否成功；
       转膜转反了；
       转膜时间过短；
       PVDF膜没用甲醇激活，或PVDF孔径与蛋白不匹配；
       槽加冰不够，且蛋白大转膜时间过长，导致蛋白降解（吃过很多次亏）。   
       甲醇浓度：普通蛋白推荐10%甲醇，小蛋白可以用20%甲醇，大蛋白可以用5%甲醇（其实用10%甲醇基本可以应对大多数不同大小的蛋白）。

（3）封闭+抗体孵育

       更换封闭剂，且过度封闭蛋白不能显色。2% BSA，5% BSA，5% 脱脂奶粉都可以尝试。
       一抗不识别检测物种蛋白：如myc和c-myc不是同一蛋白；
       没有足够一抗或二抗结合蛋白：可提高抗体浓度，延迟4℃孵育时间；
       一抗太少，多次使用失效；
       二抗和一抗不匹配；
       避免叠氮化钠与HRP标记抗体一起使用；
       洗膜过度（个人感觉洗膜时间长对常规蛋白没太大影响，信号足够强4℃洗过夜都没问题）。

 2. 条带问题：检测条带大小与预期不符及多带现象
（1）信息确认
       靶标蛋白有多个异构体或剪接体：查阅文献或查看免疫原序列，判断抗体是否识别异构体或剪接体。
       检测到未报道蛋白或同一蛋白家族相似表位结构不同的蛋白。可查阅文献，BLAST搜索，使用说明书推荐的细胞株或组织。
（2）样品制备
        细胞代数过多，蛋白表达不同；
        蛋白样本降解（蛋白质分子量降低）：① 加入足够蛋白酶抑制剂，② 样品冻-80℃重复使用，但磷酸化蛋白易降解尽量不放超过两天；
       体内表达蛋白样品具有多种修饰形式：① 需查阅文献是否有多带；② 翻译后修饰，如磷酸化和糖基化，或选择性剪接变体。许多蛋白显示条带分子量略高于预期或弥散条带；③ 用合适试剂（如去除糖基化PNGase F）处理后条带可能消失。

       靶蛋白形成多聚体：分子量是预期条带的2-3倍。需延长煮样时间。多次跨膜蛋白可尝试不煮样或使用较温和煮样方式。

（3）封闭
       条带为非特异性条带：
（4）抗体孵育
       一抗、二抗浓度过高，产生非特异结合：可以降低浓度和/或孵育时间；
       一抗、二抗浓度过低，过曝曝出背景；
       一抗结合不特异：应更换抗体。
       抗体未经纯化：应使用亲和纯化的抗体。

 3. 印迹背景

（1）有污迹

       膜变干或洗涤缓冲液与某些印迹区域接触不足，需要增加洗涤缓冲液量：避免过多膜堆积在一起。两张膜可以背靠背放置。

       膜污染：用手触摸导致汗液残留，实验所用缓冲液、转膜托盘、孵育盒有污染，用镊子等划到（咱能不能夹Marker别夹蛋白），掉地上沾的全是灰（秀儿），洗膜掉水池里了？（别问我咋知道）。使用洁净手套或镊子，并保证相关仪器试剂清洁。
（2）有斑点

       凝胶碎片粘附于印迹膜上/成块封闭剂附于印迹膜之上：① 充分溶解封闭剂，② 使用未变质的封闭液；

       抗体聚合：① 使用新鲜抗体，② 使用0.2 μm滤器过滤；

       缓冲液污染：① 使用新的缓冲液，② 使用0.2 μm滤器过滤。
* 牛奶结块咱就别用了，放了几天的牛奶用之前闻一闻臭没臭能预判到过夜后能不能结块。

（3）背景过强

        一抗/二抗浓度过高：① 提高封闭剂浓度，② 提高Tween-20浓度；

       使用错误缓冲溶液使一抗/二抗与封闭液蛋白结合：① 换用其他封闭液，② 使用亲和素-生物素系统时不用牛奶封闭（牛奶中含生物素）；

       洗涤不足：① 增加洗涤次数和缓冲液用量及时间，② 洗涤缓冲液中提高Tween-20浓度；

       膜变干（个人经验：洗涤后膜干了，也能曝出条带。洗涤前不确定）；

       缓冲液重复利用导致污染；

       曝光时间过长。

 4. 其他问题（看完顿时有种亲切感？）

       背景或蛋白有不均匀白色斑点：① 转膜有气泡，② 上抗体时有气泡，③ 转膜温度过高；

       背景有黑色斑点：① 抗体结合封闭液，② 抗体变质长菌；

       深背景出现白色条带/条带拖尾：① 抗体加入过多，② 蛋白量过高。需减少抗体浓度或降低蛋白量。磷酸化抗体也可能因为蛋白等降解出现此情况；
       某个条带变形：胶有颗粒或转膜有气泡；
       条带呈哑铃形：胶内部不均匀，或胶孔有凸起（如上图）。需重新制胶；

       分子量蛋白标准条带呈黑色：① 抗体和Marker发生反应，② 样品点入到Marker中。需注意点样或Marker间不点样；

       目的条带染色过低/过高：电泳分离不彻底。分子量大蛋白使用低浓度胶，分子量小蛋白使用高浓度胶；

       “微笑”条带：① 电压高导致迁移过快，② 温度过高改变pH和迁移速度，③ 胶不均匀。
       “牵手”条带：① 分离胶不合适，蛋白过小在最下面容易“牵手”，② 蛋白上样量过大，③ 加样后没及时电泳导致蛋白弥散，④ 上胶与下胶没贴合好，有缝隙，导致连成一片。
       条带不在一条直线：① 漏胶；② 分离胶不均匀。

       相同蛋白杂交出现大小不均匀条带：① 制胶时凝胶凝固过快，导致泳道丙烯酰胺比例不均匀。TEMED使用正常量并摇晃均匀，倒入下胶液封使用异丙醇，且不放置过久；② 样品加入量不均一。应使用蛋白loading补齐量少样品（补完发现样品齐刷儿的）。

       凝胶染色不均匀：细菌污染或抗体量不足。
       条带扭曲：转膜时间过长或电压过高，温度过高。
       “皱眉”条带：①凝胶和挡板间有气泡，② 凝胶两边凝聚不好。
       条带歪斜：玻璃板没有完全插在电泳槽中，使电压不均匀。赶紧拿出重新插紧有时候还能救回来，可别跟网上学用软件p来p去，容易把自己p进去。