Western blot ----“爱”你在心口难开

自从Western blot 被前斯坦福大学，现克里夫兰医院的小乔发明后，该技术就成为了烂大街的老鼠（划掉）工具。各科研狗虽然享受它的魔力，却又被它折磨的够呛。接下来，我将自己的玉女心经传授给大家，保证让你走火入魔并不负责任。

首先，重要的事情说三遍，这不是科普文！！这不是课本！！这不是百度百科！！我们不讲长篇大论的原理, 也不讲实验protocol 和trouble shooting，因为每个实验室的样品，条件不一，很难有通用的，而且相关内容网上唾手可得。连Western blot 还没听说过的童鞋，请自行绕道，或者留着将来备用。

那么问题就来了，挖掘机技术（划掉）我们讲什么？

简单来说，Western blot 就是用于半定量蛋白，将不同组的蛋白一起跑胶，发光，比较不同组别目的蛋白相对变化。过程繁琐，耗时之长。稍微一个细节不注意，就辛苦白费，得全部重新来过。。。以下图片是否似曾相识。。？

那么，凑字数环节（划掉）打击环节结束，我们进入正文，本篇主要是讲需要注意的细节，和可以备选的方案。

提蛋白之前，要先标记好管。不然就不记得谁是谁亲爸了样品是什么了。

提单白： 速度，温度和量是关键。裂解液请根据需求自行选择不同的强度，比较通用的是RIPA buffer全细胞裂解液。但人们往往忽略了，细胞在离开平时生活环境，去磷酸化在几分钟之内就启动了，同时蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，一旦溶解到样品里，半衰期只有30分钟，想提的好一手好蛋白，尤其是需要测磷酸化的情况，一定要快速行动，不但裂解液里头要现用现加这两个抑制剂，用来洗细胞的冷的PBS里头也要加。并且一气呵成直到煮蛋白这一步。

 

煮蛋白： 说到煮蛋白，人们往往为了避免反复冻融，会提蛋白以后分装，冻起来，用的时候再煮。事实上，如果你是提娇气的原代细胞，蛋白量本来就少，这样也会有蛋白耗损。为了保证最大浓度，可减少裂解液的量，把细胞刮下来，提完蛋白立即取一点点出来为做蛋白定量备用，剩余的直接煮，再立即冻存。做完蛋白定量，可根据浓度再稀释样品。

 

配胶： 接下来就是配胶。没什么好说的，集中精力按配方来。实验室有条件，可以买现成的胶，省时省力，降低犯罪率犯错率。

 

上样：待胶凝结，就是上样了。除了需要反复冲洗的上样针，还有一种非常好用，就是Loading tip，

 

很多公司都有卖，价格便宜，可直接与枪无缝连接。 有不同规格满足你的需要。强推。

 

跑胶：跑胶的时候用冰包起来，防止出现”笑脸“或者”哭脸“。实时观察两个夹板中间的液体，液面有没有低于内侧玻璃的线，如果低了，没关系，你会发现跑了四个小时条带还在原地 证明漏液了，可以不断过来加液体，或者重新调整一下玻璃板。

转膜：follow实验室条件

待完转膜结束，可用考马斯亮蓝染胶，或Ponceau S Stain 染膜（膜可继续使用）检测转膜情况。

封闭： 告诉你个秘密，传说5%BSA, 或者10%脱脂奶粉 TBST， 封闭五分钟就可以了，楼主亲测有效。奶粉比BSA效果好

一抗二抗：质量好的抗体，可以用封闭液把一抗二抗配在一起，一起常温孵30分钟，更可以两个来源性（兔源，鼠源等）不同的抗体，一起使用，还可以把膜根据两头的Marker 剪刀剪一剪，不同分子量大小的目的蛋白，分开同时孵，可用一个碉堡天的容器，像这个

30分钟后就可以洗洗愉快的发光去啦！用这种方法，楼主曾做到在一天内，从提蛋白到发光，同时发了9个不同的目的蛋白，科科。当然，抗体好不好，要看人品的，一般sigma, abcam这些，问题不大，santa cruz的就不要试了，

如果想用HRP直接标记的一抗，又嫌贵，其实你是可以买hrp kit的，花三个小时，想标记什么一抗就标记什么一抗，想彪标多少就标多少，妈妈再也不用担心我的效率啦。

发光：说到发光，一直是我很头疼的一个问题。不过自从暗室被淘汰，生活就好了起来。如果你还在暗室，我唯一能给你的建议是，可以同时压三张片子。

发光还有一个门道，在于发光液。其实除了你“遗传”到的那一种，还有ECL PLUS, ECL PRIME 等等来满足你的不同需求。有些甚至可以检测到ng级别的蛋白。

今天就说到这里，我科研狗一枚，欢迎留言补充，吐槽，或加微信进一步交流。

客官～有用的话就打赏我吧。科科。

（图片引用自google Image）

…华丽丽的分割线…

李莫愁博士：Western其实也是大多数人的痛，你的WB做得好，算是你老板捡到宝，WB做不好，毕业毕不了……感谢勤奋的小豆芽给我们的投稿。也希望大家能给她踊跃打赏，请毫不吝惜地夸赞她！