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Western的原理
几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污 剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多 肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去 污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。
SDS聚 丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加 入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。曲于不连续缓冲系 统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。
样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘 氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)，样品和积层胶中的 氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶 前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS多肽复 合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。
电泳 丙烯酰胺凝胶电泳通常用来查看蛋白混合物样品的复杂程度和监测纯化效果。这种方法分离效果极好，可惜很难在不丧失精度情况下放大到制备规模，因为随着胶厚度的增加，电泳时的热效应会严重干扰蛋白的泳动。
Western bloting首 先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到NC膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放 一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到NC膜上，NC膜可以与蛋白 质通过疏水作用产生不可逆的结合。但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。而电泳印迹可以更快速有效的进行转 移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋 白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不 同。湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。半干转移，用浸透缓冲液 的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相比，这种方法要快（15-45 分钟）。
转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗体特定IgG的抗体（二抗）可以直接购买，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）。碱 性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以将H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化 成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺 并发光，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也 使用其它探针如放射性标记的DNA，可以检测印迹中的DNA结合蛋白。
在Western bloting实验中，有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色。这种方法叫直接法，与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特 异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。
Western bloting要注意的一些问题
1、为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品（比如β-actin，GAPDH）或阳性血清）；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS代替）；无关对照（用无关抗体）
2、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景
3、实验设计时所釆用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所釆用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。
4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。
5、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。
6、封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。
7、加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；
容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用
上样电泳： 上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳 Buffer（别小气，重复使用会降低缓冲能力的）。当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结 束了。
电泳结果检查：如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋 白PAGE胶电泳染色方法。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot实验，很多人会选择省略掉这一步——同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以说明问题。所以最经济实惠的方法是：丽春红S，直接染色转 移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰Western结果。丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。
转膜：经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行Western Blot的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。
Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（NitrocelluloseBlotting Membranes，NC）和PVDF膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。选择的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单 位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果 后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。
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