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蛋白质印迹法 (免疫印迹试验) 即 Western Blot，其工作原理是经过 PAGE (根据分子大小) 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 (例如硝酸纤维素薄膜) 上，然后将目的蛋白与特异性抗体进行孵化。由于抗体只与目的蛋白结合，未结合的抗体被洗掉，只留下与目的蛋白结合的抗体。最后通过显影检测结合的抗体，条带灰度与蛋白量相对应，因此可以反映蛋白质的表达情况[1]。 WB 实验包括制样、电泳、转膜、孵育抗体和显影等多个步骤（如图 1），莫慌莫慌，小 M 带你来一一化解。
图 1. Western blot 的流程图[2] 万丈高楼第一步：准备材料 要想实验节奏稳，准备工作那可要妥妥的——缓冲液配制。小 M 在此总结了 WB 实验中所涉及的各类缓冲液的配方，拿走拿走别客气～ 
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表 1. Western blotting 各类缓冲液配方 默默问一句，看完这些配方，您倦了吗？疯狂计算，反复称量，您累了吗？小 M 且在这里为您献上 MCE 多种速溶颗粒产品 (可戳往期→让“速溶颗粒”解放你的双手)，不用犹豫，省时省力，您且受累收好呗！ 只要样品做得好，完美结果少不了 配好了溶液，就该轮到把样品的蛋白分离出来了！那么样品处理该注意什么呢？ 低温操作！低温操作！低温操作！重要的事说三遍。为最大限度保证蛋白原有结构，所有涉及蛋白的操作都需在冰上进行！ 1. 细胞裂解液的制备。在冰上用预冷的 PBS 洗涤细胞。根据每 107 个细胞加 1 mL 裂解缓冲液的比例加入预冷的裂解缓冲液。细胞重悬液在 4 ℃ 下放置 5-10 分钟，期间剧烈震荡 3-4 次，每次 30 秒，实现充分裂解。放入离心机内，12,000 rpm 离心 13-15 分钟。将上清液转移到冰上预冷的离心管中，弃去沉淀。 如果是制备组织裂解液的话，解剖目标组织一定要迅速，建议多次离心去除杂质。 2. 蛋白样本制备。取少量裂解液，通过 BCA 法进行蛋白浓度测定。取出 50 μg 蛋白对应的溶液至离心管中，加入 1×SDS 上样缓冲液调平体积。将样本缓冲液中的细胞裂解液在 100 ℃ 下煮沸 5-10 分钟。 上样跑胶需选择合适凝胶 紧张又忙碌地制备完蛋白样品，然后就是上样和跑胶。(恰恰恰，跑个胶，先检查下作业呗！) 首先是根据蛋白大小选择合适的凝胶，参考下表 2。 然后将蛋白样品上样至 SDS-PAGE 凝胶孔中，记得在样品旁边的孔内点上 marker。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量一般为 20-30 μg，电泳时长一般 1.5 小时，先用 80 V 跑 30分钟，使各样本处于同一水平，待 marker 开始分离后将电压调至 120 V 再跑 1小时。  表 2. 蛋白大小与推荐的凝胶百分比 转膜不要丧气，成败在此一举 顺利到了转膜这一步，已经快完成实验啦~ 转膜分为湿转和半干转两种，转膜时间应根据蛋白大小进行相应调整。 湿转是指转印过程中凝胶和膜被浸入充满转印缓冲液的槽中，适用于大多数各种分子量的常规蛋白转印。半干转是指凝胶和膜被夹在预先润湿缓冲液的滤纸之间，滤纸与平板电极直接接触。湿转使用更广泛，成本低；半干转相对来说更加节约时间，通常只需要 10 min 即可，具体时间视蛋白大小和仪器条件决定。不论是半干转还是湿转，小 M 都有几个共通小 tips 要给你：1 提前将 PVDF 膜浸入预冷的甲醇中 5s 来激活；2 转膜时要注意赶走膜与胶之间的气泡；3 转膜材料的放置顺序（如图 2a） 图 2. 转膜的物料顺序：阴极，海绵 (湿转需要)，滤纸，胶，PVDF 膜，滤纸，海绵 (湿转需要)，阳极[3] 胜利的曙光：敷抗体显影 行百里者半于九十，大家在最后一步一定要坚持！通常，在孵育一抗前需要用封闭缓冲液在室温下封闭膜 1 小时，以使膜表面可有效地附着蛋白质或抗体，然后用 PBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟，接着将封闭后的膜与稀释后的一抗在 4 ℃ 下过夜孵育。洗涤后使用稀释后的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育 2 小时，用 PBST 洗涤后加入 ECL 显色液孵育 1-3 分钟，利用暗室显影技术采集化学发光图像。(注意注意：加入 ECL 显色液后应全程避光！否则前功尽弃。)看到这里，相信大家对 western blot 的流程已经了然于心了吧，是不是迫不及待地想上手练习啦 相关产品 传统的细胞、组织快速裂解液，适用于 Western Blot (WB)、免疫沉淀 (IP) 及免疫共沉淀 (Co-IP) 等实验。 磷酸酶抑制剂 Cocktail III (EDTA-Free, 10× in ddH2O) 是一种质谱兼容的通用型蛋白和磷酸酶抑制剂 cocktail。 常用作 SDS-PAGE 缓冲液，也可用作 WB 缓冲液。 常用于 Western Blot 和 ELISA 的抗体封闭步骤，可在 15 分钟内完成封闭。 常用作 ELISA、Western Blot 等免疫分析实验中的洗涤缓冲液，也可用于抗体稀释及封闭液的配制。 3-Color Prestained Protein Marker 分子量范围为 10-190 kDa。 Ultra High Sensitivity ECL Kit 用于检测辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体及其关联的抗原。 MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务 参考文献 [1] Mahmood T, Yang PC, et al. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 2012 Sep;4(9):429-34. [2] Meftahi, GH, Bahari, Z, Zarei Mahmoudabadi, A, Iman, M, Jangravi, Z , et al. Applications of western blot technique: From bench to bedside. Biochem Mol Biol Educ. 2021; 49: 509– 517. [3] Wenying Pan, Wei Chen, and Xingyu Jiang, et al. Analytical Chemistry 2010 82 (10), 3974-3976 |
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来自： medchemexpress > 《激动剂》
一通操作猛如虎，一看结果想哭
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