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根据自己的实验体会，总结做好 WB 的一些心得，希望对你实验有帮助。围绕着实验的每个步骤展开叙述，这样可能更具体更好理解。 该部分较为重要的是配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜。常出现的问题有：A. 凝胶出现花纹：此时应检查原料中过硫酸铵（AP）粉末是否受潮。B. 凝胶聚合时间较长：聚合时间由 AP 以及 TEMED 决定，通常在 30 min 左右，AP 不新鲜会导致聚合变慢。此外还需注意环境的温度也很重要，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加 AP 以及 TEMED 的量，但通常不会超过 1 h，若超过 1 h 甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。 该部分蛋白样品本身很关键，若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。除此之外 loading buffer 的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时将样品与 loading buffer 混合均匀也应注意。 首先在跑积层胶时应尽可能使样品压齐，若上样量较大（如细胞蛋白通常上样在 20-30 甚至 40 ul），可适当减小电压跑 20-30 min，待压齐后方可开始分离。 该环节电流的大小，转膜的时间决定是否能成功将蛋白转上，而具体的参数应取决于所要蛋白的分子量大小，应反复摸索，本人在实验中得出的经验为：10 KDa：200 mA 1 h，60 KDa 70 V，2 h，90 KDa 70 V，4 h，200 KDa 70 V，6 h。 此外还有如下几个细节问题需要注意： 膜的选择：PVDF 还是 NC，0.22 μm 还是 0.45 μm。 转膜液中甲醇的量：通常在 10%-20%，蛋白分子量较大时可适当减少，蛋白分子量小时应适当增加，建议先从 15% 开始。 该步骤一般不易出现问题，常见的有室温 2-3 h，或者 4 度封闭过夜，但仍需强调一点的是有些抗体的使用需配套使用特殊的封闭液。 通常购买到一种新抗体后，还是建议先按说明书推荐的浓度比例在室温孵育 2-3 h。若该抗体效价较好，应该显带很漂亮，尤其是在抗体刚买时间不长，然而事情往往不能尽如人意。我们在遇到一个不好的抗体时该怎么办？可通过延长孵育时间（如：4 度过夜孵育甚至室温过夜孵育），增大抗体浓度。如果你想尽了一切可能结果仍然很不理想，建议还是换抗体吧，不要再浪费时间与精力了。 个人认为洗膜液洗 3 遍，每遍 10 min 足以。没有必要过多次数过长时间，膜的背景不好很多时候并不是没洗干净，更多的应该去考虑抗体浓度是否过高等其他原因。本人实验过程中曾经做过两个抗体，其他的条件一样（甚至是从一张膜上剪开的），背景却相差很大，你能说是没洗干净吗？洗二抗同样如此。 选择好一个合适的条件不要轻易改变，另外相比一抗，二抗作用的时间应严格控制，实践证明一抗时间长点可能没什么关系，而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。 本文作者系丁香园中级站友：hangpengzhou 点击阅读原文查看 Western blot 实验 |
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