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我们实验室有句话口口相传：做上 WB，走上不归路。WB 难，磷酸化蛋白的 WB 就更难了。做为在磷酸化蛋白上摸爬滚打多年的老司机，总结了一些经验，希望能助各位科研民工们一臂之力，少走弯路，早日出结果发 paper，迎娶白富美，走向人生巅峰！！！（文末开学豪礼等着你） Q1: 什么是蛋白质磷酸化？ 磷酸化是将磷酸基团加在中间代谢产物上或加在蛋白质上的过程。 Q2: 蛋白质磷酸化的作用？ 蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素介导的蛋白降解等过程。细胞信号转导活动都是由一系列蛋白传递链构成的，信号传导的过程中涉及到多种蛋白质的可逆磷酸化过程。蛋白质通过可逆磷酸化，以及不同的级联反应，可以将信号放大传递等。由此可见蛋白质磷酸化在细胞信号传导过程中担负着重要的作用。 Q3: 检测蛋白质是否磷酸化以及磷酸化水平的常用方法？ Western blot 是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，利用 SDS-PAGE 分离蛋白样品，随后转移到印迹膜上，之后利用磷酸化特异性抗体来鉴定目的蛋白。 有人会说 western blot 还不好做吗？那可是研究生的技能标配，但是磷酸化蛋白的 western blot 就不能小看了，多少人在这里摸爬滚打，绞尽脑汁。下面重点来了，赶紧搬个小板凳认真学起来。 想跑出好的磷酸化蛋白条带，与做普通的 Western Blot 相比，磷酸化 Western Blot 有一些要额外需要注意的事项： 01 检测样本是否表达目的蛋白 实验前需先查阅文献或通过预实验检测该样本是否表达目的磷酸化蛋白，若正常情况下样本的磷酸化水平过低或不表达，可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，正确的刺激会帮助得到最佳实验结果。 02 检测总蛋白是否有变化 封检测磷酸化蛋白之外，往往也需要检测总蛋白。仅仅是检测到磷酸化蛋白表达量的升高或降低并不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值增加或减少了才能说明磷酸化水平的变化。 03 点样时加入 Marker 做磷酸化蛋白 Western blot 时，除了目标蛋白的条带以外，往往会出现非特异性的条带。如果磷酸化抗体不佳，甚至只有非特异性的条带，而没有目的条带。所以点样时需同时加入合适分子量范围的 Marker，根据 Marker 进行比对，查看条带的分子量，是否是目的条带。否则有可能会误以为一些非特异条带是目的带，白白耗费了大量精力得出错误的结果。 04 抑制磷酸酶的干扰 由于蛋白的磷酸化是可逆的，会被磷酸酶去磷酸化，所以在样品制备和整个检测过程中，需要抑制或避免细胞内源性和外源性的磷酸酶的干扰。针对细胞内源性的磷酸酶，在样品制备时，需要在裂解液中加入足量的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。外源性的磷酸酶主要是由实验过程中的其它试剂带入的，比如要确保实验试剂中不含磷酸酶等；此外，样品中或其它试剂中带的细菌也会分泌外源性的磷酸酶，所以另一个关键是要尽量使用无菌清洁的试剂和凝胶，必要时加入防腐剂。 所谓细节决定成败，除了以上注意事项，操作细节尤其重要，稍不注意就会事倍功半，这就是为什么很多小伙伴在做磷酸化蛋白的 WB 实验时，很疑惑明明按照步骤操作的，为什么结果还是不理想，所以大家一定要注意以下细节。 磷酸化蛋白容易脱磷酸化，除提取蛋白时要迅速小心外，也可在上样缓冲液和转移缓冲液中加入磷酸化酶抑制剂 Na3VO4 等。  只要按照以上注意事项操作，小白也会成为实验小达人，做出理想的磷酸化蛋白条带。最后向还在跑 Western 的同学们致敬，条带会有的，文章会有的，开学豪礼也会有的 关注博士德公众号 boster-1993 即可参与活动 文章及题图来源：博士德 |
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