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开学伊始，总是伴随着大量的工作，实验，标书，论文，文章。。。七头八线(果子：这个词语找不到，但是能理解意思)，说不得想要是有几个分身便好了，提蛋白系列的结束也就意味着要开始用这些蛋白来做点事情，所以接下来的计划是： western blot 常规分子以及现在想到的注意事项， western blot 小分子蛋白的分离和当时想到的注意事项， western blot 的条带分析。
之前讨论了提蛋白的方法，都是为了今天的western blot，一般做分子实验肯定绕不开此项目，也是必须要掌握的，同时也是大家都很懂的，我也只是把自己平时遇到现在想起来的做个总结。 Western blotting 步骤如下：（1）洗板子：洗板子很重要，是开始做实验的基础，所以板子一定要洗干净，如果8块板子，认认真真洗15-20min，一定可以洗干净。板子要当天做完当天洗，不要留到第二天。用洗洁精写，不需要用布洗，直接带丁晴手套或者芦荟手套去搓，先洗四个边，然后再用手搓中间，再用自来水冲洗，直到不挂水珠就可以了，如果实在不知道什么样算可以，就用自来水正面来回冲30s，反面来回冲30s，一般都可以洗干净。然后再用ddH2O冲洗，同上。我一般都会直接放在架子上，自己收起来，当然放在烤箱也可以，但一定要记得收回来。为什么洗板子啰嗦这么久，是因为板子对实验的成功也至关重要。 （2）接下来一些比较常规的操作，就大概说一下。 （3）配胶：取一套玻璃板（我的板子都是做完洗的，每次都是直接用的），用洗洁精清洗干净后，用去离子水冲洗干净。分离胶和浓缩胶的配方附在后面，看自己需要多大分子量，按需配置就可。 （4）灌胶：1ml加样枪灌分离胶，距顶端0.5cm处用无水乙醇液封，常温置30min；倒去无水乙醇，用去离子水冲洗一下，用滤纸吸干残留水分，灌浓缩胶，立即插入梳子，静置30min。 （5）上样：每孔保持同样质量同样体积的样品，在一孔中加入marker，避免浪费，一般加3-4ul的marker就够了。 （6）电泳（SDS-PAGE）：电泳分离蛋白，通常条件浓缩胶为恒压70V，电泳到浓缩胶和分离胶分界处就可以换电压，换成120V直至溴酚蓝到达底部为止。 （7）转膜：PVDF膜在甲醇中泡5min，制备“三明治”，从上到下依次为滤纸-PVDF膜-胶-滤纸，切取胶块，然后按顺序装膜，放于电泳槽中（红对红、黑对黑），在4℃冷库中，恒流180mA，电转120min。 （8）封闭：转膜结束后，5%的脱脂奶粉室温封闭1小时。 （9）孵育一抗：封闭结束后，用1TBST洗膜35min；孵育一抗，4℃冷库内摇床过夜，以使抗原抗体充分结合。 （10）孵育二抗及显影：将于4℃过夜的膜取出，用1TBST洗膜35min，孵育二抗，室温1小时；1TBST洗膜35min；ECL显影液，A:B=1:1；发光。 （11）数据分析：应用Bio-Rad Quantity One software软件进行灰度值统计，目的蛋白的灰度值除以内参Actin的灰度值以校正上样误差。
我知道大家可能都知道怎么做，但是我还是来啰嗦一下必要的这几个东西的原理，只说关键点。这样更有利于自己来做和变通。Western的原理我就不讲了。 几个关键点30%丙烯酰胺：避光，4℃保存，pH不能超过7，因为光和碱会使其发生脱氨基反应。 APS和TEMED作用：聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺聚合形成的高分子。这个聚合反应是自由基聚合，而自由基的聚合需要引发剂，APS就是引发剂，TEMED则可以催化APS产生自由基，从而加速丙烯酰胺聚合。APS一定要新鲜最好分装后保存在-20度，超过2周的APS最好扔掉，或者已经反复打开使用多次的APS都别用。 SDS：可以为电泳提供钠离子，与蛋白质相互作用，使蛋白质变性，形成负电荷SDS-蛋白质复合物，去除蛋白的电荷，解离蛋白之间的氢键，同时还能去除蛋白的疏水作用，使得蛋白分离仅受蛋白质分子量的大小影响。 甲醇：能使SDS与蛋白分离，甲醇浓度越高SDS与蛋白分离越快，但高浓度的甲醇对蛋白有固定作用，不利于蛋白从胶里跑出来。大蛋白转印降低甲醇浓度，另外SDS须添加；而小蛋白则需增加甲醇浓度。甲醇的另一个作用是降温，旧的电转液由于电解质的消耗和甲醇的挥发，电转时电流或电压变化更快、温度升高也更快，电转液最多用三次。 分离胶压胶：可用过无水乙醇，异丙醇，双蒸水，正丁醇等，封闭分离胶,是为了让胶更快的凝固，防止氧化同时还可以起到压胶平行的作用。水或醇，二者均可，如果压不平，那绝对不是溶液的问题，而是手法的问题。至于区别，水会稀释界面，醇会从界面吸水。并不存在一般人所说的谁压的更平的说法。而是影响的sds和ph及界面的胶浓度，当然影响都是非常小的，一般都是可以忽略的。这就是为什么用什么封的人都有。但如果非要严格要求的话，低浓度的用水封，高浓度的用醇封。不管大小分子，我都是用醇封的，并没有太大的影响。 PVDF膜：0.45um 用于一般蛋白；0.2um用于分子量小于20kD蛋白。 操作所有试剂均需戴手套，口罩，基本所有试剂均有神经毒性，同时还可以防止污染样品。 通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。 而对于半干转，一般选择恒流（膜面积的3倍：3 mA/cm2） 之间一般60分钟，同样根据蛋白分子量适当调节时间。 滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。 滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。 因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。 滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。
遇到的问题:gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。 抗体很关键，抗体好，就可以做到事半功倍，即使其他做的差点，结果也是勉强可以看，若是抗体不好，那就需要考验技术了。一定要选择好用的抗体，会让你有飞一般的感觉。 分离胶浓度与最佳分离范围：
分离胶浓度与最佳分离范围以上是分离胶浓度选择和分离范围，但是在选择时，一般大于27kd，选择10%的胶，大于15kd选12%的胶，大于10kd，选15%的胶。转膜条件不管时多大的分子（10kd-180kd），都可以用105v,105min。关于选择恒压还是恒流我也是纠结了很久。 要搞清楚这点就需要弄明白转膜效率是和电流有关还是和电压有关，还是和二者都有关？ 关于恒流和恒压的关系及转移效率取决于什么：想要搞清楚恒流和恒压的关系及效率，首先肯定要明确的是电阻的变化，我们只要了解到电阻的变化，恒压或者恒流后的变化就会相对好理解。湿转法的两电极板加胶/膜叠层浸入缓冲液槽中，整个缓冲体系形成一个电阻，由于刚开始时缓冲液可维持相对恒定的ph值，所以此时的电阻应该是相对恒定的。随着转膜的进行，产生的热量会增加，电阻也增大。（转膜的时候一般都会加冰块，降温，或者是放到冷库，使整个体系保持在相对低温的状态，只要电流不是特别大，电阻增大的应该不会特别多）。接下来看恒流或者恒压的影响。 转膜就是要让凝胶中带负电荷的蛋白在电场的作用下向正极迁移，当正好迁移到膜上的位置时停止；我们知道电流是电压的定向移动形成的，所以个人觉的转移速度的大小主要取决于电流的大小；恒流转移时，转移速度是恒定的，随着电阻的增加，电压也会增加，随着时间推移，产热增加。这样的优点是转膜效率较高，比较平稳，但是产热量较大，高电压产生的热量尔导致的胶层变形； 恒压转移时，由于电阻是逐渐增大的，所以电流是开始到最大，以后逐渐降低，即转移效率开始最高，以后逐渐降低，优点是产热较少，但转移效率受影响； 为什么自己会选择恒压，是因为用恒流时，发现电转完整个槽子的温度有很明显的升高，虽然好像对结果看起来没有很大的影响，但是当用成恒压后电转完成，整个槽子的温度并没有明显的变化，同时结果也比较稳定，虽然确实存在效率要低些，但是180kd以下都是没有问题的，而且伯乐的Trans－blot semi dry transfering cell操作手册上提供的是恒压的方案。
配好胶，抗体棒，剩下最最重要的一点就是黑对黑，红对红。。。你懂的。。。
分离胶
浓缩胶电泳液 5X: glycin 77g, Tris base 15.1g, 加ddH2O至1000ml
电泳液 1X: 5*电泳液 200ml ,10%SDS 5ml ,ddH2O 795ml
电转液 10X: glycin 105g, Tris base 22.5g ,加ddH2O至1000ml
电转液 0.5X: 10*电泳液 50ml, 甲醇 50ml, ddH2O 900ml
TBST 10X: Tris base 24.2g, Nacl 80.1g, 加ddH2O至1000ml
TBST 1X: 10*TBST 100ml, ddH2O 900ml, Tween 20 1ml
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