9. 条件的摸索
DDD. 用的是Santa Cruz的抗体，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否是我要的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发现大分子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解 -80度冻存的细胞，4度12000g离心5分钟，取上清，与分子克隆（第二版）上的加样buffer混合，沸水变性5分钟，上样。不知道是哪里出了问题？
解答：建议：1、首先确定您提的蛋白质量如何？可用PIERCE公司的BCA试剂盒测蛋白的浓度，一般来讲，其浓度应该在几-20微克/微升。
2、若是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度，您目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD，建议分别用10％和12％的胶。60-80V，1小时左右。跑过积层胶与分离胶的线时，换用100V，3-4小时。
3、转膜，建议恒压，15V，不用转2小时，45分钟足以。您所说的大蛋白转过去的，并不是真正的少，而是因为在提的蛋白中大蛋白本身就很少。我曾经也转过2小时，但和45分钟的区别并不大。
4、根据MARKER的条带（我的是7条带：14、18、25、35、45、66、116KD），您根据MARKER的条带剪下25与35之间（29KD）的条带，45-66之间（50KD）的条带。这样第一，可以节省抗体，第二，您要的目的条带肯定在上面。
5、延长1抗、2抗孵育时间（我曾室温1小时，4度过夜），适当加大1抗浓度。
6、我买的也是Santa Cruz的抗体，我觉得质量还可以，我想您应该先找其他方面的原因。
EEE. 电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。
解答：电泳的条件：样品的分子量决定了胶的浓度，一般使样品跑至胶的中部即可。正常条件下，电泳时溴酚蓝和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以决定电泳的电压和时间。建议你用恒压80－100伏。
FFF. BIO-RAD的半干转运系统有一个很致命的弱点就是无法控温（我用的就是这种），当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。
就转膜时，是采取恒压还是恒流的问题，我想和大家探讨一下，我感觉我这个系统用恒流很容易烧胶，我的胶有68cm2，用50mA恒流来转膜，刚开始电压就很高，有20 v左右，而用恒压，开始电流有110mA，但15min后，电流就降到8OmA，30min后就稳定在40mA，不就相当于恒流吗？
解答：恒流时电压逐渐升高的原因是湿滤纸逐渐变干因而电阻逐渐增大的缘故，如果电压升得太快，可以使滤纸更湿一些以克服。就我的感觉，20V的电流30min以后20Kd以下的分子丢失很多，不过我用的是小胶40cm2，不知有无不同。
GGG. 我想尽量提高转膜的效率（我的实验要求转到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些办法？
解答：不管怎么转都会存在蛋白转移不完全（电压过小时间过短）或过度转移（电压过大时间过长）的问题，鱼（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建议把胶切成两半，比如以35KD为界，分别进行转膜，下半时间短，上半时间长一点，应该会好一些。
HHH. 请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？
解答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。
III. 1、煮好后的样品，若没有及时上样分离，应如何保存，可以保存多久？2、有没有人在用bio-rad的小型垂直电泳槽，有没有操作手册？3、湿式转移时是否必须要用bio-rad的专用滤纸？4、恒压转移的条件如何确定，因为我要分离小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白质，转移条件能够相同吗？5、凝胶的浓度是不是可以用一个浓度？书上写不同的凝胶浓度分离的分子量范围不同，还给出了一个线形范围，是不是不在这个范围内也能分离，只是就不是线性范围了？
解答：1、煮好后的样品，放到-20，我们在一个月后此样品，效果一样。
2、bio-rad的小型垂直电泳槽的操作手册在他们的主页Bio-Rad USA上有。
3、转移时一般的WATERMEN滤纸就可以。
4、转移条件是和蛋白质大小有关的：以次确定电压和时间。具体可让ptglab帮你定夺。
5、凝胶的浓度也是和分离蛋白质大小有关。不是随心所欲选的，否则分离效果可能不是你所期望的。
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