Western blot 条带分析

跑过WB的童鞋都知道，有时候显影出来的结果简直逆天到让你怀疑人生，怀疑自己。不过，世间万物均有迹可寻，在这里，小编根据自身经验以及其他小伙伴的经历，对各种奇葩结果进行一番总结归纳，快来瞅瞅吧，说不定就有你的呢。

 

 

问题 可能原因 验证或解决办法 背景高 封闭不充分/未加封闭剂 延长封闭时间 更换合适的封闭剂（脱脂奶粉、血清、BSA等） 一抗浓度过高 增加一抗稀释倍数 抗体孵育温度过高 4℃孵育 二抗非特异性结合 设置二抗对照（不加一抗），降低二抗浓度 一抗或二抗与封闭剂有交叉反应 在孵育和洗涤液中加入Tween-20以减少交叉反应 洗膜不充分 增加洗涤次数 膜不合适 NC膜比PVDF膜背景低 膜干燥 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 没有阳性条带或很弱 一抗、二抗等不匹配 订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参来验证二级检测系统的有效性 一抗或/和二抗浓度低 增加抗体浓度，延长孵育时间 封闭剂与一抗或二抗有交叉反应 封闭时使用温和的去污剂，如Tween-20 更换封闭剂（脱脂奶粉、BSA、血清或明胶等） 一抗不识别目的物种的靶蛋白 检查说明书，或做ClustalW比对，设阳性对照 样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过低（抗原无效） 设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加标本上样量至少每孔20-30ug蛋白,样本制备时使用蛋白酶抑制剂,或分级提取目的蛋白 转膜不充分,或洗膜过度 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,需正确的转膜操作,勿过度洗膜 过度封闭 使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液，或更换封闭剂，减少封闭时间 一抗失效 使用有效期内抗体,分装保存,避免反复冻融取用, 工作液现配现用 二抗受叠氮钠抑制 所用溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP的抑制剂) 酶和底物失效 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物,使用新鲜的底物 曝光时间过短 延长曝光时间 多非特异性条带或条带位置不对 细胞传代次数过多，导致其蛋白表达模式分化 使用原始或传代少的细胞株，或多做平行实验 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式：乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等 查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小 蛋白样本降解 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 新蛋白或同族蛋白分享同种表位的不同剪接方式 查其它文献报导，或BLAST搜寻，使用说明书报导的细胞株或组织 一抗浓度过高 降低抗体浓度，可以减少非特异性条带 二抗浓度过高 产生非特异性结合 降低抗体浓度，增加二抗对照 选择特异性更强，只针对重链的二抗 抗体未纯化 使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带 蛋白存在二聚体或多聚体 SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10 min， 以增强蛋白质解聚变性 背景有白色/黑色斑点 转膜时有气泡或抗体分布不均 尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动 抗体与封闭剂结合 过滤封闭剂 暗片现白条带 一抗或二抗加入过多，导致高浓度HRP把底物消耗过快 稀释抗体的浓度 目的条带过低/过高 SDS-PAGE胶浓度选择不合适 调整胶浓度，分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶 “微笑”条带 迁移过快 降低电泳速度，低温电泳（冷室） 电泳温度过高 条带拖尾 蛋白量太大 摸索最适蛋白量 一抗浓度太高 降低一抗浓度，减少孵育时间，同时洗涤时严格按照要求时间和次数进行 一抗孵育时间太长 出现重影 压片时，轻微移动了一段距离 X光片放上去之后，就不要动了，即使放歪了也没关系 出现非均一性背景 膜干燥 在每一步的操作过程中，都要注意不要让膜干燥 某个条带变形 凝胶中存在气泡或不溶性颗粒 配胶过程中要小心，使用无杂质的液体 条带呈哑铃状 凝胶配制不合格 充分混匀，防止胶凝固后不均一 拔梳子时要小心，避免胶孔变形 最边缘条带弯曲 电泳电流不均一 换用新的电泳槽 不使用两边的两孔 条带出现纵向条纹 样品中含有不溶性颗粒 去除样品中的不溶性颗粒 转膜不充分 膜没有完全均匀湿透 使用100% methanol浸透膜 靶蛋白分子量小于10,000 选择小孔径的膜，缩短转移时间 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液 甲醇浓度过高 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 转移时间不够 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间