蛋白免疫印迹(western blotting)一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测3个部分组成,是根据抗原抗体特异性结合检测样本中某种蛋白的方法,与ELISA不同的地方在于WB是一种半定量的检测方法。 操作流程如下: 下面详细介绍一下每个操作步骤: 一、样本的制备 (1)样本一般是组织和细胞,根据样本类型的不同,选择合适的裂解液:
(2)抑制剂,根据研究的目的蛋白进行选择,假如要检测磷酸化的蛋白含量,就要对磷酸酶进行抑制,现在很多公司都有多种抑制剂的混合物
(3)要加入loading buffer(BME、DTT,目的是减少蛋白高级结构的形成)
(4)煮沸变性:一般是99°C,10min,水浴锅煮沸时,防止EP管盖弹开,使水浴锅内的水进入。 二、凝胶电泳 (1)配胶。这里说的都是SDS变性胶,先配分离胶,再配浓缩胶。根据目标蛋白分子量的大小,选择合适的分离胶浓度,分子量越高,分离胶的浓度越低。浓缩胶一般用的都是5%。配胶时需注意以下几点: ①玻璃板清洗后,为了使表面的水快速晾干,可以在烘箱中放置几分钟,拿出来的时候一定要晾到室温再灌胶,不然很容易产生气泡; ②配胶用的试剂一般都是在4度冰箱保存,当我们按比例配好混合液的时候,要等混合液恢复室温时,再灌胶,不然也很容易产生气泡; ③加水液封时,速度要慢,可用1ml枪沿着胶板上沿反复移动,不然很容易将分离胶冲变型。
(2)电泳 采用SDS-PAGE电泳,每孔上样量为10μl总蛋白,上样时,先加marker,如有空置的加样孔,须加等体积的1×loading buffer,以防相邻泳道样品的扩散。开始电压为80v,使样品跑得慢一些,充分浓缩,到达分离胶后调为120v,电泳至溴酚蓝要跑出即可终止电泳,对10-12%的胶来说,80-90min足够,对15%的胶来说,时间要再延长一些,然后进行转膜,关于电泳液,也可以回收1-2次,根据实验室情况决定。不过建议先配10x的,然后现用现稀释。 三、转膜 (1)关于膜的选择 现在用的最多的是PVDF膜,用之前需注意:①先在甲醇中浸湿膜15s,保证膜由不透明变成半透明;②小心将膜放入双蒸水中浸泡2min;;③小心将膜放入转移缓冲液中平衡至少5min (2)转膜液 转膜之前先提前配好1x转膜液,放在4°C冰箱。对于小分子量蛋白质(<100),按照10x转膜液:甲醇:蒸馏水=1:2:7的比例配制1x转膜液;对大分子量蛋白质(>100),可加入10%的甲醇,并且适当加入SDS,浓度控制在0.1%范围内。 (3)转膜时间 按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择合适的转移时间。下表是转移时间,可以做一个参考:
(4)转膜方式—湿转 转膜在冰浴中进行,凝胶和转印膜之间不要留有气泡,因为气泡是绝缘的,假如气泡位于凝胶的条带处,该处条带就不能转移到膜上了,同时要注意电极方向。 (5)转膜效率 如果想看转移后的效果,可对凝胶进行染色,常用的是丽春红染色,但其实有一个更简单快速的方法就是通过预染marker来判断,看凝胶上是否有marke残留以及转印膜上marker的清晰度。 四、免疫学检测 (1)封闭(降低背景,占据膜上剩余的结合位点,使抗体只能与膜上的抗原特异性结合):一般用的封闭液有5%的BSA和5%的脱脂奶粉,但对于磷酸化的抗体或生物素标记的抗体不能用脱脂奶粉,只能用5%的BSA。封闭时间室温1-2h即可 (2)一抗孵育:封闭结束后,用TBST稍微洗一下膜,并将一抗用稀释液进行稀释,具体的稀释比例因抗体不同而不同,需做预实验确定。通常用自封袋进行一抗孵育,2-5ml即可,孵育时间推荐4°C摇床过夜。一抗孵育时,要注意一抗的种属来源。 (3)洗膜:一抗孵育结束后,回收一抗,用TBST进行洗膜,5min/次,洗4-5次即可。 (4)二抗孵育:洗膜结束后,加入二抗,室温摇床1-1.5h,然后回收二抗,再次洗膜。二抗的种属要与一抗的来源相对应,例如一抗是兔抗,二抗就要是抗兔抗的抗体。 (5)检测 酶标抗体:化学发光检测,ECL 荧光抗体:要在激光扫描成像仪进行结果观察,例如Odyssey、STORM
五、常见问题及解决方案 1、无条带或弱条带
2、非特异性条带
3、高背景:一般目的条带弱,延长曝光时间后,均会产生高背景
4、有较多污点
5、条带位置偏移/错误
|
|