【原】图解WB | 第5期. Western blot蛋白条带位置异常？先别慌！

在前几期的Western blot曝光及数据展示的学习后，不少同学发现，虽然我能曝出条带，但是又出现了新的问题：我的目的条带不在它预计的位置，比如我的目的条带预计在55kD左右，但是与marker比对后，在蓝色55kD大小的marker平行的曝光条带中并未看到目的蛋白条带，而是在蓝色55kD与40kD之间看到一条较浓的蛋白条带，为了解决这一问题，首先我们应该知道我们是通过蛋白marker来辅助判断目的蛋白条带，所以存在两大关键对象：蛋白marker、上样蛋白样品。

关键对象一：蛋白marker

还是以26616举例，其说明书写了它的应用：

·在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳期间监测蛋白迁移（即发挥指示作用——肉眼观察电泳进展到哪一程度）

· Western 印迹后监测蛋白转印到膜上（粗略观察转膜是否成功）

· SDS-聚丙烯酰胺凝胶和 Western 印迹上的蛋白大小分析（依据marker寻找目的蛋白可能条带）

那为什么它可以指示蛋白呢？因为marker是将一些特定大小的纯化蛋白与染料共价耦联，拿我们最常用的Thermo Scientific PageRuler Prestained Protein Ladder 26616来说，70kD的蛋白用红色染料耦联，10kD的蛋白用绿色染料耦联，其他180/130/100/55/40等用蓝色染料耦联，同色又可以通过将蛋白浓度加倍来提示其大小，显示出粗浅不一的蓝色marker条带，这样就能实现蛋白的可视化。正因为与染料共价耦联，所以如下图所示，在不同的凝胶成分与凝胶浓度中电泳时，其marker的移动程度不同。

在其说明书中也提及，预染蛋白marker在不同的电泳体系中可能会有一些误差，并不能精确对等目的蛋白的分子量，只能发挥相对的指示作用。（p.s只要不是区分特别相近的大小分子，如50kD与60kD，那就不影响哦~）

关键对象二：上样蛋白样品

上样的蛋白样品是将蛋白与SDS结合，确保带足够的负电荷，使得蛋白在凝胶中的迁移速率完全是由于其分子量大小，即电泳过程中，分子量较小的蛋白跑的快，分子量较大的蛋白在电泳过程中移动速率较慢，同marker受不同电泳体系的影响，我们在电泳时也要根据分子量大小来选择合适的凝胶浓度，如跑自噬LCIII蛋白，12%或15%的凝胶要比10%凝胶其蛋白定位可能更加精准（特别是在需要裁膜孵育抗体的情况下）。

除此之外，部分蛋白存在翻译后修饰，如磷酸化、泛素化等，或者是翻译后的剪切（即蛋白分子量大小发生改变），还有部分蛋白存在异构体，这些异构体可能完全或部分被抗体识别，即在膜上看到除了预计蛋白条带外，还能看到其他更浓的蛋白条带，当然还有一个大家容易忽视的情况，即蛋白降解，也同时会影响条带位置。那以上这些情况，都可以通过查阅该目的蛋白相关的资料和文献得以解决，那在实际曝光过程中，如果你多组样品重复曝光，均发现其蛋白条带异常，在排除了制胶（成分添加错误），电泳（电压/电泳液成分错误/电泳内槽漏液较快），转膜（特别是凝胶在转膜时被异常拉伸）等操作失误外，不妨考虑你的刺激条件是否影响其翻译后修饰或翻译后的剪切，也许就发现了一些有意思的现象！

那么这就是本期的全部内容啦，你学会了吗？大家对于推送内容有任何问题或建议可以在公众号菜单栏“更多--读者的话”栏目中提出，我们会尽快回复！

参考资料

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