【原】有效分离 1kDa 小肽的 蛋白电泳方法

我们实验室有计划做一些小肽的电泳检测，目前是查阅文献阶段还未正式实验，现将看到的一篇可行的文献整理过来，方便大家查阅，文献作者为暨南大学生殖免疫研究中心曹佐武教授。文章最后附上我们买的小肽Marker说明书，供大家参考。

聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE) 是分离蛋白质的常用方法，样品的蛋白质分子热变性解聚后与 SDS 结合形成带负电的蛋白质-SDS 复合物，复合物在电泳中的迁移率取决于蛋白质的分子大小，使用均匀浓度的 SDS- PAGE 来分析分子量在 15~ 200 kDa 的蛋白质时，电泳迁移率与分子量的对数成线性关系，但分离分子量小于 10 kDa 的多肽效果差。

国外曾经报道了分离小分子肽的三羟甲基氨基甘氨酸(Tricine )-SDS- PAGE 方法，该方法可分离分子量在1~ 100 kDa 的蛋白质。十多年来，一直利用这种较简便的不连续梯度胶分离小分子肽，国内也有一些利用该方法的报道。但暨南大学生殖免疫研究中心曹佐武教授在用该系统分离小分子肽的实验中发现，该方法分离大于2 kDa 的蛋白质效果尚可， 但分离小至 1 kDa 的小分子时效果并不理想，表现为带型弥散。通过改进，曹佐武教授建立了一种效果理想的分离小至 1 kDa 的小肽的方法。

1 材料和方法

1.1 器材

尿素( promega)，巯基乙醇(E.Merck， Darmstadt) ，过硫酸铵(AP)(Sigma，USA)， TEMED (Sigma ，USA) ，丙烯酰胺(Sigma)，甲叉双丙烯酰胺(Sigma)，Tris碱(Serva)，SDS(Amresco)。    

低分子量蛋白质标准品(上海生物化学研究所)，特低分子量蛋白质标准品C6210(Sigma)，胰岛素(Sigma)。蛋白质微量电泳仪(Bio-Rad Lab，USA)，Mini protein II垂直电泳槽(Bio-Rad Lab ，USA)，凝胶成像仪(Bio-Rad)。

1.2 溶液配制

1.2.1 Tricine-SDS-PAGE蛋白质电泳溶液准备

(1)正极缓冲液(10x) 121.14 g Tris 溶于400 mL 重蒸水，用1.0 mol/L HCl 调至pH 8.9，定容至500 mL。

(2)负极缓冲液(10 x) 将60.55 g Tris ，89.58 g Tricine 及5 g SDS溶于400 mL 重蒸水中，加水至终体积为500 mL。

(3)凝胶缓冲液(3x)将181.5 g Tris ，1.5 g SDS溶于 400 mL 重蒸水中，用1mol/L HCl滴定至 pH 8.45，再加水稀释至500 mL 。

1.2.2 丙烯酰胺储存液配制

(1) 3C丙烯酰胺储存液将48 g丙烯酰胺和1.5 g甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中至100 mL。

(2) 5C丙烯酰胺储存液用重蒸水溶解47 g丙烯酰胺和 2.5 g甲叉双丙烯酰胺成100 mL 溶液。

(3) 6C丙烯酰胺储存液用重蒸水溶解46.5 g丙烯酰胺和3.0 g甲叉双丙烯酰胺成100 mL 溶液。

1.2.3 样品与样品缓冲液样品缓冲液由4% SDS、12%甘油、50mmol/L Tris、2 %巯基乙醇(v/v)，及少许溴酚蓝组成，pH 6.8。

低分子量蛋白质标准品含有97.4 kDa、66.2k Da、43.0 kDa、31.0 kDa、20.1 kDa、14.4 kDa等6种成分，再补加3.5 kDa的胰岛素肽，与样品等体积混合，上样前沸水浴5 min ，每次点样量10μL。特低分子量蛋白质标准品(SigmaC6210)，每次点样 10μL。    

2 实验方法

2.1 不同组成的丙烯酰胺溶液的配制

Tricine-SDS PAGE 的凝胶由不同分子组成的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合液聚合而成。其中浓缩胶由 3C丙烯酰胺储存液配成4%的丙烯酰胺溶液聚合而成，夹层胶由3C丙烯酰胺储存液配成10%的丙烯酰胺溶液聚合而成，致密胶由 5C 丙烯酰胺储存液或6C丙烯酰胺储存液配成16.5%的丙烯酰胺溶液(添加或不添加36.5%尿素)聚合而成。凝胶配方见表1。

2.2 灌胶

凝胶制作采用三层不连续胶的结构，由致密胶+夹层胶+浓缩胶构成。灌胶前，各种丙烯酰胺溶液分别加入10μL 的过硫酸氨和1μL 的TEMED，随即灌胶，先灌下层的致密胶，再覆盖以中间的夹层胶，然后铺浓缩胶。静置以聚合形成三明治式的不连续梯度凝胶。

2.3 点样

取 10μL 的蛋白质标准品，煮沸 5 min 使蛋白质与 SDS 结合变性，小心点入凝胶的点样孔中。

2.4 电泳    

内槽加入负极电泳缓冲液，外槽加入正极电泳缓冲液，形成 Trcine-SDS-PAGE 电泳系统，用20 mA恒流电泳 3 h。考马斯亮兰染色后，用甘油溶液孵育，并用凝胶成像仪成像。

3 实验结果

3 种分离胶用于分离低分子量蛋白质标准品和特低分子量蛋白质标准品的电泳结果见图1.其中图1A为由"6C+U'致密胶和夹层胶组成的分离胶的电泳结果:图IB为"5C +U'致密胶和夹层胶组成的分离胶的电泳结果:图1C为由“5C致密胶和夹层胶组成的分离胶的电泳结果，

图1A 显示用"6C+尿素"凝胶电泳可清晰地分离低分子量蛋白质标准品中的7条带，也基本可分离出特低分子量蛋白质标准品中的6条带，但1kDa小分子的带型弥散，而第3条带自身显示红色，且与第2条带的分子量接近，因而带型效果差。图1B能很清晰地显示低分子量蛋白质标准品中的7条带和特低分子量蛋白质标准品中的6条带，特别是1kDa小分子的带型也很清晰。图1C能显示低分子量蛋白质标准品中的7条带，但是只分离出特低分子量蛋白质标准品中的5条带.1kDa小分子未见明显的带型。可见，"5C+尿素"凝胶分离小分子蛋白的电泳效果最好，尤其是 1kDa带很清晰。    

4讨论

常规聚丙烯酰胺电泳方法分离 10 kDa以下的小肽效果差。传统上分离小分子肽用连续梯度胶，制作较麻烦，而且需要专门的灌胶设备。Schagger 等改用Tricine-SDS-PAGE系统后，对小分子肽的分辨率明显提高。利用16.5%凝胶浓度、11 %甘油，按"小孔胶+夹层胶+浓缩胶”模式制作不连续的梯度胶，分析昆虫细胞的表达产物，可见小于 14 kDa 的几个小分子成分，并呈现清晰的3-4条带，而且还能分离2-3 kDa的肽段。利用"6C +U”配方配制的凝胶能分离小至 1 kDa的肽段，多年来国内分离小分子肽一直沿用这种方法，没有实质的改进。但是，作者发现，利用这种凝胶在Tricine-SDS-PAGE系统中虽能分离小至 1kDa 的肽段，但效果不理想，主要表现为小分子成分形成的带型弥散，如图1A的泳道2所示。

经过几年的摸索，作者发现，调整聚丙烯酰胺凝胶的分子组成后，可以改善分离小分子肽的效果。本文采用“5C +U”丙烯酰胺溶液配成的聚丙烯酰胺凝胶，使丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联度为 5.05%，分离特小分子量的蛋白标准品 C6210，可见清晰的6条带，而且1 kDa的小肽的带型也非常清晰(如图1B的泳道2所示)，明显优于“6C +U’凝胶的分离效果。可见，调整凝胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的分子比例可直接影响凝胶的分离效果，这可能是由于二者的比例影响凝胶的分子间隙。有报道认为，当凝胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的分子比例为20/1 时，分子间隙最小。本文调整分子比例后，胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的分子比例接近 20/1，使凝胶分子结构更致密，更有利于小分子肽的分离。但是，即使凝胶中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的分子的交联度接近1/20，单凭这2种分子本身组成的凝胶还不能分离小至1 kDa 的肽段，该凝胶分离特小分子量的蛋白质标准品，仅分辨出5条带，没有显示出 1 kDa 的肽段(如图1C)所示。加入尿素后的凝胶能清晰地显示1 kDa 的带型。可见，尿素能增强分离效果。    

相关问答：

1.Tricine-SDS-PAGE与传统SDS-PAGE的区别：

(1)分离胶中更高的Tris浓度：终浓度为0.75M；普通SDS-PAGE为0.375M

(2)分离胶和浓缩胶中的pH都是8.45

(3)分离胶中更高的交联度（C）-5%，普通的SDS-PAGE为C一般为3.3%。

小肽的电泳：

2.关于阴极缓冲液和阳极缓冲液：

Tricine-SDS-PAGE系统不同于常规的SDS-PAGE，使用两种缓冲液电泳。电泳槽内槽是1×阴极缓冲液，含有Tricine和SDS。外槽是1×阳极缓冲液，是0.2M Tris。由于电泳槽内外槽缓冲液不一样，电泳前要检测电泳槽是否漏液，如果漏液的话将导致内外槽缓冲液混合，导致电泳结果不好。如果发现内槽缓冲液漏液，可以将外槽缓冲液加满到和内槽缓冲液齐平。

3.关于电泳时的电压：

浓缩胶一般用稳压80-100V，如果使用新鲜的缓冲液，这时的电流应该在20mA左右，如果电流太小，请检查缓冲液以及电泳设备是否有问题。当指示前沿至浓缩胶和分离胶交界时，电压可以调高到120-150V。整个电泳时间约需2-3小时。

4.关于电泳的指示前沿：

由于溴酚蓝在Tricine-SDS-PAGE系统中泳动很快，很快就跑到缓冲液中去了。超低分子量蛋白Marker和2×Tricine 上样缓冲液中的指示前沿是考马斯亮蓝G-250。电泳中只要指示前沿跑不丢，小肽就不会跑丢。然而，考马斯亮蓝G-250作为指示前沿的缺点是在分离胶中比较弥散。如果电泳时间较短，染色时会遮挡3KD左右的小肽。

5.小肽的染色：

由于小肽还有较少的氨基酸，染色时结合的染料就少，导致染色灵敏度比较低。上样时要加大上样量。另外，低于5KD的小提容易从PAGE胶上脱离，染色前最好有个固定步骤(0.5％戊二醛，30%乙醇)。为了更好的染色小肽，可以选择FastBlue蛋白染色液（Cat No：RTD6202），该产品除具有染色快，无毒，灵敏性高等特点外，还能对小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脱色中从凝胶中脱离，是常规染色液的理想替代品。

6.小肽的转膜/Western Blot实验

由于小肽比较小，转膜时要注意小肽非常容易透过PVDF膜。两种方法可以解决这一问题：两张PVDF膜重叠在一起；缩短转膜时间（半干法转移，200mA 15-20分钟就可以了）。转膜使用0.22 μm的PVDF膜。湿转（转膜缓冲液加20%甲醇，不加或少加SDS，200mA 30-35分钟）。

7.小肽电泳文献：

[1] Schagger, H. & von Jagow, G. Tricine–sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1–100 kDalton. Anal. Biochem. 166, 368–379 (1987).

最原始小肽电泳的文献。

[2] Schagger, H. Tricine–SDS-PAGE. Nature Protocols. 1,16-23，2006

87年的作者Schagger在Nature Protocols 开刊文章，写的精细，值得推荐。

[3] 两篇国内文献，主要讨论尿素的作用。

(1)多肽的电泳分离 2004

(2)有效分离1kDa小肽的Tricine-SDS-PAGE方法 2004

附.我们实验室买的小肽Marker说明书