WB的无敌战神之路 —— 制胶

WB做得好，导师捡到宝。对于刚入实验室的热血青铜宝宝，WB可谓处处都是轰炸区，一个不小心，分分钟落地成盒。为了帮助大家快速get变强秘籍，提升吃鸡率，我们在此重磅推出《WB实验全攻略》系列文章，助力各位早日成为实验室MVP，进阶WB无敌战神。

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在前两期的分享中，我们介绍了WB中蛋白提取(WB的无敌战神之路 —— 蛋白提取)和定量步骤 (WB的无敌战神之路——蛋白定量)，你有没有好好学习呢？今天我们将接着介绍制胶步骤，凝胶是蛋白的分离介质，胶的好坏直接影响到最终结果的颜值，因此是非常重要的步骤哟~那么，让我们开始吧~

聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，它有两种形式：

·SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)：最常用的形式，蛋白上样前被变性，根据分子量进行分离。

· 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)：适用于天然未变性样本的复合物分析，蛋白质在电泳过程中保持完整的状态，根据电荷和分子量进行分离。

01

聚丙烯酰胺凝胶成分

THE MEANING OF LIFE

蛋白质的分离取决于凝胶所形成的孔径大小，凝胶的孔径由浓度决定，即单体和交联剂的总克数在每100毫升凝胶溶液中的占比。常见的聚丙烯酰胺凝胶其实是由两块不同浓度的凝胶组合而成的，分别称为浓缩胶及分离胶。

· 浓缩胶的浓度是5%，主要作用是将样本在上样时的高度差缩小，使得所有的蛋白能够处在同一起跑线上，使条带更美观；

· 分离胶是真正的分子筛，通过聚丙烯酰胺形成的立体孔道，对不同分子量大小的蛋白进行分离。分离胶浓度选择应根据目标蛋白分子量确定。WB实验中，绝大部分蛋白的分子量位于20-100kDa范围，因此在没有特殊要求的情况下使用10%的凝胶，可以基本保证不同分子量蛋白的较好分离。

表1 不同凝胶浓度所适合的分离蛋白的分子量和线性分离范围

表2 不同浓度分离胶配方 (10 mL)

表3 浓缩胶配方 (10 mL)

分离胶和浓缩胶中的成分基本相同，以下为配方解析：

① ddH₂O (double distilled H₂O)：这个你懂得~

② 30％丙烯酰胺(Acrylamide)：由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称BIS)按一定比例混合而成，起到分子筛作用，用于分离不同分子量的蛋白。丙烯酰胺是神经剧毒，聚丙烯酰胺毒性相对较小，但操作时仍需要注意防护。30％丙烯酰胺母液会降解，要4℃避光保存；

③ Tris-HCl, pH 8.8/6.8：缓冲液，用于保证胶的pH值正常，pH值不准会使最终的带型比较诡异；

④ 10%SDS(十二烷基硫酸钠)：阴离子去垢剂，打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合形成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有电荷，掩盖各蛋白分子间天然的电荷差；

⑤ 10％APS(过硫酸铵)：提供丙烯酰胺和BIS(亚甲丙烯酰胺)聚合的氧自由基，是聚合的引发剂。在室温下不稳定，10%APS一般保质期为一周左右，现配现用效果更好，有強氧化性和腐蚀性；

⑥ TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)：反应的催化剂，可催化APS产生自由基，从而加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合。4℃保存遮光保存，有臭味，有腐蚀性，具强神经毒性，需注意防护。

02

制胶流程

01

组装制胶装置，将玻璃板卡在制胶架上，底部与海绵胶条贴紧；

02

按照以上分离胶配方配制所需浓度的分离胶(TEMED最后添加)，充分混匀后，将分离胶溶液用移液枪小心地灌入组装好的玻璃板中，枪头紧贴玻璃板内壁；

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在分离胶表面轻缓地覆盖一层ddH₂O液封分离胶使表面平整，室温静置凝固约30-60 min；

04

使用以上配方配制浓缩胶(TEMED最后添加)，并充分混匀；

05

待分离胶充分凝固后，小心倾斜或倒置弃去分离胶上层的ddH₂O，用洁净的滤纸伸入玻璃板吸走剩余的ddH₂O；

06

立即将浓缩胶溶液用移液枪小心地灌入分离胶上层，插入点样梳，确保凝胶中或梳齿周围没有气泡。让凝胶在室温下凝固约30-60 min。

03

注意事项

1

配胶用玻璃板和边条应及时洗净，确认无疙瘩凸起，最好用洗洁精等去污力强的洗涤剂清洗。

2

如果制胶时发现漏胶，在组装玻璃板时要注意玻璃板底部是否和制胶的海绵垫紧贴，否则容易漏胶。有两个建议可以参考：

1）在玻璃板底部裹一张保鲜膜再放到海绵垫上压紧；

2）在制胶前在玻璃板底部用较高浓度琼脂糖凝胶(没错，就是跑DNA的那个)封底，凝固后再进行灌胶，这个亲测好用，妥妥的不会再漏了。

3

凝胶需充分混匀，由于配方中存在容易起泡的SDS，所以吸打时不要速度过快，尽量不要产生气泡。混匀完后，可将液态胶静置15秒左右使胶中的微小气泡上浮，再进行灌胶。另外，加胶时可以使用两档吸一档打的方式，防止再打入空气。如果胶中有气泡或者其他杂质，你的条带可能会发生意外的弯曲。

图 气泡或杂质导致条带弯曲 (lane 4)

4

凝胶需充分凝固(分离胶与水界面之间出现明显的分层线)，如果胶没有凝固充分就进行电泳，跑出来的条带会一言难尽。如果放置大于1小时，凝胶仍未凝固，需考虑凝胶成分是否加错，尤其要考虑APS是否变质。TEMED催化APS释放相关化学基团，再由APS释放的基团催化凝胶聚合，所以如果APS不新鲜加再多的TEMED效果也不明显，这就是为什么推荐APS每周新鲜配置的原因。其实没有APS和TEMED也能凝固，也就花一周多的时间吧~

图 凝胶不充分将导致WB条带扭曲

5

液封是制胶过程不可缺少的一步，平整的分离胶有助于得到平整的条带。常见的液封液是异丙醇和乙醇，也可用超纯水替代。液封时应紧贴玻璃板，由左至右缓慢滴加。液封时冲击力过大不仅不能压平分离胶，反而会直接溶入分离胶使分离胶凹凸不平。

6

制好的凝胶如果不马上进行电泳，可以从制胶架上拆下来，保留梳子，然后用保鲜膜包裹好放入4℃冰箱，保存时间不应超过1周，最好是能现配现用。

7

如某段时间需要经常跑WB，分离胶及浓缩胶均可按照比例配好 (除APS及TEMED外) ，过滤后作为储存液避光存放于4℃，可存放1个月，使用时，先放室温平衡，再加入相应的10%APS及TEMED即可，可以减少大量重复时间。市面上也有聚丙烯酰胺凝胶预混液出售。

8

如发现WB的条带或者电泳时的溴酚蓝很粗，可以适当增加浓缩胶的长度。

9

点样梳需与玻璃板匹配，如制作1.5mm厚度的凝胶应使用1.5mm的点样梳，否则拔掉梳子后，可能会发现每个胶孔都被胶堵了。

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好物推荐

THE MEANING OF LIFE

1.三层胶

对于分子量小于10KDa的蛋白，可以尝试使用Tris-Tricine胶 (三层胶) 体系。其中间隙胶可以阻挡一些大分子量的蛋白，从而使小分量的蛋白或肽段能够在分离胶内得到更好的呈现。

图 Tris-Tricine三层胶示意图

表4 Tris-Tricine-SDS-PAGE配方

2.梯度胶

梯度胶是从上至下凝胶浓度逐步升高的凝胶 (4-20%) ，需通过梯度混合器制作，低浓度的聚丙烯酰胺溶液首先从底部灌入，而后溶液浓度呈梯度上升，因此在凝胶的上方孔径较大，而在凝胶的下方孔径较小。梯度胶比单一浓度凝胶的分离范围宽，可以同时分离10-300kDa (甚至更大范围) 的蛋白。梯度胶的制作比普通凝胶的制作流程复杂一些，但如果你来自土豪实验室，可以买现成的预制胶 (上面提到的普通凝胶也有预制胶) ，省时省力还更安全 (减少了接触有毒有害物质) ，批间一致性好，再也不用提前制胶，随时来一场说跑就跑的电泳，梯度胶跑出来的条带还更好看噢，可以说是胶中爱马仕，除了贵没有缺点，哎，贫民窟女孩流下了羡慕的泪水~

今天，你学“废”了吗？敬请期待我们的下期内容分享哦~