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对于三分靠运气，七分靠努力western blot实验，蛋白的提取制备是重中之重。说真的，没做过Westernblot，都不敢说自己念过研究僧，它已经成为众多研究僧的家常便饭。虽然，WB实验天天做，But，漂亮的结果并非想有就能有...... So,我又开始总结了。 一、裂解液的选择，就是我们经常用到的RIPA+PMSF 一般裂解液包含以下几个组分: 1. 首先是缓冲系统：裂解液pH过高或过低都可能使蛋白质变性析出或水解，因此通常采用近似生理pH的buffer来作缓冲体系。Tris-HCl缓冲液因其缓冲能力强，不容易与其它离子形成不溶物，且与整个电泳系统兼容性好，因此是裂解的首选缓冲液。
2. 其次是盐离子浓度：通常大家习惯以生理盐浓度作为裂解液的盐离子浓度。在提胞浆蛋白等易溶组分时，也有通过低盐而实现低渗，从而使细胞胀破以实现质膜分离的，这种情况下一般使用不超过50mM的NaCl。当盐离子浓度过高时，部分蛋白可能会因盐析而出现沉淀， 此外过高的离子浓度会导致泳道内局部电流过大，最终跑出笑脸状条带，即使有少数蛋白可能需要高盐提取的，或借助盐析除去干扰蛋白的，最终NaCl浓度一般也不高于500mM。 3. 然后是离液剂：常用的离液剂有两类，一类是以尿素或硫脲为代表的离液剂，另一类则是各种表面活性剂（俗称去垢剂）。 尿素和硫脲性质类似，其对蛋白质的助溶可能是通过与蛋白质之间形成大量氢键实现的，做过包涵体纯化的童鞋对8M尿素的助溶能力想必一定非常清楚。在做蛋白提取时一般可以用6-8M尿素或/和2M硫脲助溶，这个组合尤其在制备二维电泳的样本中被普遍使用。 在整个SDS-PAGE系统中，有很关键的一点，就是借助SDS使蛋白带上等比例的负电荷使得蛋白的泳动速度仅与其分子量相关。但对于一个特定的蛋白质该优先使用何种表面活性剂目前没有发现有固定的规律，也没有相应的理论作为支持，因此当常规的裂解液无法有效地提取到目的蛋白时，则可能需要自行尝试不同的表面活性剂的提取效率。尤其对于一些难溶的膜蛋白，建议大家参考文章报道的裂解液或原理类似的裂解液。（这一点不太清楚，希望有大神解释一下）。 4. 重要的蛋白酶抑制剂：组织或细胞内通常含有大量的蛋白酶，在提取过程中这些蛋白酶被释放出来，有可能消化目的蛋白，因此抑制住这些蛋白酶的活性对于防止目的蛋白的降解极有帮助。常见的蛋白酶抑制剂有：PMSF、Aprotinin、Leupeptin、 Pepstatin，AEBSF-HCL，其中PMSF对多种不同活性中心的蛋白酶都有极好的抑制作用而且效率高，因此基本是必加的试剂。蛋白酶抑制剂具体加多少，需要看你提取的组织或者细胞的特性而言。我们实验室正常使用量是RIPA：PMSF=100:1。另外，做磷酸化蛋白的Western blot时，还需要加入磷酸酶抑制剂，避免磷酸化形式的蛋白发生去磷酸化。 （来自网络） 5、还原剂 许多蛋白天然条件下存在二硫键而形成多个分子的聚合体，另有少数蛋白在制样的过程中也会自发形成二硫键，在裂解液中引入还原剂可以有效地还原二硫键， 二、裂解操作 1、细胞裂解（悬浮细胞和贴壁细胞） 悬浮细胞：可直接离心收集，并用PBS洗涤2-3次去除培养基中的血清便可以裂解。 贴壁细胞：可能大家习惯于胰酶消化后再裂解，但很多蛋白都可以被胰酶消化，在WB检测时经常可以检测到消化出来的短片段而误以为是杂带，可用细胞刮刀刮下细胞，再像悬浮细胞那样洗涤后再裂解，或者直接在培养瓶或培养皿中直接裂解效果更好。 不管是悬浮细胞，还是贴壁细胞，操作都是相同的：加完裂解液后，将细胞置于冰上（但不要冻住）使其充份裂解，然后再冰浴超声以打断DNA分子，取出少量以用于测定浓度，其它的加上Loading buffer煮沸变性就好了，细胞蛋白离心之后的不溶物不会太多。 2、组织裂解（小编的实验室做的最多的就是组织蛋白提取，哭死） 组织蛋白提取则相对较复杂，首先应设法除去脂肪和血液等杂质，尤其是制备脾脏、心脏和胎盘等富含血液的组织，尤其要洗净血液，防止后续因内源IgG产生干扰，可用PBS或生理盐水（加PMSF）洗涤2-3次去除组织中血液 不同的组织含血量不同，需要加入的蛋白酶抑制剂的量也不同，需要多次实验摸清楚具体条件。 取好组织后先需要研磨，研磨前用剪刀将组织块剪碎可以有效的减短研磨时间。现在实验室常用的研磨“神器”主要有两种：液氮研磨和玻璃匀浆器（另还有电动匀浆器适合大规模样品制备）（我们实验室没有电动研磨器，所以我自己习惯于用液氮冻住之后，在研钵里研碎，我觉得这样会比剪碎的效果更好，这个过程保证组织不会融化，然后再离心去血去脂肪，最后移到匀浆器中裂解）。组织样品研磨完成之后，后续大致的步骤与细胞样品处理类似，与细胞样品不同的是，组织内经常富含结缔组织，有些在常规裂解液中难以溶解，因此不溶物通常比细胞样品多。 （来自网络） 三、防止降解 前面已提到，一些组织和细胞内经常含有蛋白酶，在提取蛋白的过程中，有可能消化目的蛋白，总体上可以从以下几个方面来避免蛋白被降解： 1、使用蛋白酶抑制剂抑制细胞或组织中释放的蛋白酶活性。PMSF是廉价但高效的抑制剂，因此几乎是所有WB实验中必选之抑制剂。 2、提取蛋白时，避开蛋白酶的最适活性温度。所有的步骤都可在低温下完成，所有的试剂都需预冷，以降低蛋白酶活性，防止蛋白降解。尤其是消化系统相关的组织样品尽量取新鲜的样品制备，制备方法选用液氮研磨的方法，将样品降解降到最低。 3、加快提取速度。对于组织来说，取样顺序最先取消化系统相关的组织（如胃、大小肠、肝脏、胰腺等）和富含巨噬细胞的组织（如肺)，然后取生殖相关的组织（如卵巢、子宫、睾丸等），最后取心、脾、肾、脑等器官。取下的组织冻存在液氮或-80度冰箱里。少数细胞系，如Raw 264.7、U-937等，也含较多蛋白酶，在提取时也需要快速提取。 四、避免杂质的干扰 在蛋白提取中经常可能会混入一些杂质，后期影响电泳分离效果，常见杂质有： 1、器材制备 在提取蛋白时尽可能使用洁净器具，防止样本被污染。一些反复用的器具如匀浆器、研磨杵等需保持干净。 2、核酸或脂类 核酸和脂都可能与蛋白质结合，如果制备的样品中含有大量的脂类或核酸，则有可能使目的蛋白泳动速率拖慢，或者可能形成大的复合物而不能进入浓缩胶。核酸通常可以通过超声方法打断成小片段，提取蛋白的过程中，低温超声震动是必不可少的一步。脂类则在获取组织时尽量避开（如肝脏），在制样后可将样品放置低温，有部分油脂可能漂浮在液面上，只需用枪吸取弃之即可。 五、特殊提取方法 有些蛋白只在特定的细胞或特定的细胞器中以较低丰度分布，如果只提总蛋白，很可能达不到Western blot检测下限， 因此可能需要分离特定的细胞类群或细胞器，建议大家参考文献操作。 另前面已述，有少数蛋白在常规裂解液中不易溶解，可能需要特殊的手段才能提取，尤其是一些多次跨膜的蛋白或是核内蛋白，建议也参考文献方法提取。 六、浓度调平与评估 蛋白提取完成后，建议用BCA法准确测定浓度，以确保上样量清楚可控，也可以通过SDS-PAGE染胶大致判断提取效果和相对浓度，以及蛋白是否裂解充分、有无降解。 为了保证每道的上样量一致，经常需要将高浓度的样品调低，或将低浓度的样本浓缩。调低样本浓度一般可直接用RIPA稀释之后加4×Loadingbuffer使最终RIPA和4×Loading buffer的比例为3:1，浓缩样本则建议进行超滤操作，以保证操作前后离子浓度变化不大。 最后给大家一个口诀，是之前在网上看到一个大神总结的：免疫印迹七步走，蛋白提取是重头。 缓冲体系要得当， 中性略碱是主流。 离子浓度莫极端， 钾盐切记谨慎投。 尿素硫脲有奇效， 去垢剂需更深究。 防止降解颇重要， 抑制剂要正确谋。 PMSF作用广， EDTA性价优。 切莫漏加还原剂， 巯基分子破二硫。 RIPA buffer是首选， 特殊提取细运筹。 裂解细胞无他巧， 勿借胰酶把懒偷。 组织裂解先除血， 千方百计研磨透。全程低温要把握， 快速操作记心头。 避免杂质生干扰， 勿引蛋白核酸油。 提完浓度要测准， 跑胶染色见良莠。 常带内参显严谨， 结果明朗不发愁。 勤学苦练基本功，他日名声传五洲。 基金、课题设计、科研辅导群 备注：入群学习 从以下20个热点入手，每天给大家分享干货：
而这些研究方向参与疾病发生发展过程的分子机制，可以归纳总结为一下几类研究： ①分子（DNA、RNA、蛋白质、小分子）的表观遗传修饰； ②分子拷贝数的表达变化差异； ③RNA分子的剪接加工、出核、细胞组织水平的时空变化研究； ④特殊的一群细胞类型研究、细胞通讯微环境研究； ⑤具有临床应用潜力的新技术（CRIPSR）或者载体（膜结构、细胞等）； ⑥关注细胞生理学现象：自噬、凋亡、线粒体失功等； |
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