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第九章 基因工程和基因组学 1．什么是遗传工程？它在理论上和实践上有什么意义？ 答：遗传工程是将分子遗传学的理论与技术相结合，用来改造、创建动物和植物新品种、工业化生产生物产品、诊断和治疗人类遗传疾病的一个新领域。 广义的遗传工程包括细胞工程、染色体工程、基因工程、细胞器工程等。狭义的遗传工程即是通常讲的基因工程。本章只涉及狭义的遗传工程，即基因工程。 理论意义：遗传工程（基因工程）中的DNA重组主要是创造自然界中没有的DNA分子的新组合，这种重组不同于精典遗传学中经过遗传交换产生的重组。 实践意义：遗传工程（基因工程）技术的建立，使所有实验生物学领域产生巨大的变革。在工厂化生产药品、疫苗和食品；诊断和治疗遗传疾病；培养转基因动植物等方面都有非常重大的意义，即基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。（详见第10题）。 2．简述基因工程的施工步骤。 答：基因工程的施工由以下这些步骤： ⑴.从细胞和组织中分离DNA； ⑵.利用能识别特异DNA序列的限制性核酸内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段； ⑶.将酶切的DNA片段与载体DNA（载体能在宿主细胞内自我复制连接），构建重组DNA分子； ⑷.将重组DNA分子导入宿主细胞，在细胞内复制，产生多个完全相同的拷贝，即克隆； ⑸.重组DNA随宿主细胞分裂而分配到子细胞，使子代群体细胞均具有重组DNA分子的拷贝； ⑹.从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA分子； ⑺.使克隆的DNA进一步转录成mRNA、翻译成蛋白质，分离、鉴定基因产物。 3．说明在DNA克隆中，以下材料起什么作用。 (1)载体；(2)限制性核酸内切酶；(3)连接酶；(4)宿主细胞；(5)氯化钠 答：⑴. 载体：经限制性酶酶切后形成的DNA片段或基因，不能直接进入宿主细胞进行克隆。一个DNA片段只有与适合的载体DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效地进入宿主细胞，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌和酵母人工染色体等。 ⑵. 限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶是基因工程的基石。在细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子，以限制或阻止病毒侵染。这种酶能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，在这一序列内将双链DNA分子切断。 ⑶. 连接酶：将外源DNA与载体相连接的一类酶。 ⑷. 宿主细胞：能使重组DNA进行复制的寄主细胞。 ⑸. 氯化钠：主要用于DNA提取。在pH为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加入一定浓度的氯化钠，使钠离子中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。另外，氯化钠也是细菌培养基的成分之一。 4．有一个带有氨苄青霉素和四环素抗性的质粒，在其四环素抗性基因内有一个该质粒惟一的EcoRI酶切点，今欲用EcoRI位点克隆果蝇DNA，构建一个基因库，连接的产物转化大肠杆菌菌株DH5 ，试问：⑴. 在培养基中加入哪一种抗生素用于选择阳性克隆？⑵. 对哪一种抗生素有抗性的质粒携带外源果蝇DNA片段？⑶. 如果有的克隆可抗两种抗生素，如何解释？ 答：⑴.在培养基中加入四环素结合影印法可用于选择阳性克隆。 ⑵.对氨苄青霉素有抗性的质粒携带外源果蝇DNA片段。 ⑶.这种克隆是没有受到EcoRI酶解的原始质粒或这些克隆都是自连形成的非重组体。 5．在构建一个真核生物核DNA库时，需要考虑哪些因素？ 答：核基因库是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。通常方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度（大于15kb）的DNA片断，与适宜的载体连接构成重组DNA分子，根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。若载体是质粒，则将连接的重组DNA分子转化感受态细胞，收集所有的菌落即成为质粒基因库。如果载体是噬菌体或粘粒（cosmid），则将重组DNA分子体外包装成噬菌体后，感染细菌细胞，将所得到的所有重组噬菌体集中即是基因库。如果载体为BAC或YAC，将重组人工染色体导入相应的宿主细胞，收集得到的所有细胞即成为基因库。 真核生物的核DNA大，因此在构建核基因库时，通常要选择能够接受较大片段的载体，以减少克隆数量。若构建的基因库是以分离结构基因为主要目的的，通常选用λEMBL，λGEM，或粘粒。而那些将用于基因组作图和分析的基因库，则多选择BAC或YAC为载体。 6．根据下列凝胶电泳分析的结果，构建一个限制性酶图谱，并表明酶切位点及片段的碱基数，片段总长度为1300bp。电泳分析结果如下：
答：限制性酶切图谱从左到右是，200个碱基对位置是酶II的切点；350个碱基对位置是酶I的切点；图谱总长是1300个碱基对。 7．在下列6种限制性酶图谱中，有一种排列方式与凝胶电泳的带型是一致的。3种酶分别是：E： EcoRI、N：NcoI、A：AatII。 试回答： ⑴.根据电泳中DNA带型，选择正确的图谱并说明原因。 ⑵.在将这块凝胶转移后进行Southern杂交分析，带星点的是与pep基因杂交的信号带，说明pep在图谱中的位置。 答：⑴.从上到下的第五条应该为正确的图谱，因为经过上述三种酶切后，与左面的电泳图完全一致。 ⑵.根据Southern结果和酶切图的位置，pep应该在第五条图谱的3与4之间。 8．简述将除草剂基因转移到植物基因组的过程。 答：以农杆菌介导为例，说明这一过程。 ⑴.在无菌的组织培养下，从植物体的种子或无性器官建立高效的再生体系； ⑵.依据植物的种类，选择合适的质粒载体，将抗除草剂的基因连接到载体上，再将质粒引进根癌农杆菌； ⑶.植物的再生组织与上述农杆菌共同培养； ⑷.经过农杆菌感染的组织在含除草剂的培养基中进行选择； ⑸.抗除草剂的组织再生植株； ⑹.再生植株在温室进行抗除草剂试验； ⑺.有性繁殖的种类还要进行自交、回交测定和纯化。 9．简述基因组遗传图谱与物理图谱的异同。 答：遗传图谱的构建是根据任一遗传性状（如已知的可鉴别的表型性状、多型性基因位点、功能未知的DNA标记）的分离比例，将基因定位在基因组中。因此，遗传图谱是根据等位基因在减数分裂中的重组频率，来确定其在基因组中的顺序和相对距离的。物理图谱的构建不需要检测等位基因的差异，它既可以利用具有多型性的标记，也可以利用没有多型性的标记进行图谱构建，它将标记直接定位在基因库中的某一位点。 实际上这两种途径都需要利用分子遗传学的技术和方法。尽管这两种图谱是分别构建的，但是它们可以相互借鉴、互为补充，作为基因组图谱利用。 构建物理图谱的原因是：遗传图谱的分辨率有限、遗传图谱的精确性不高。 10． 简述基因工程在工、农、医三方面的成就及发展前景。 答：基因工程在工业上的应用主要是生产医药产品，最典型的例子是通过细菌生产胰岛素，治疗糖尿病。到目前通过细菌已经生产了表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等10多种医药产品。 基因工程在农业上的应用：以转基因植物为标志的植物基因工程已经培养出许多抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆的优良品种和品系，如在全世界范围内大量推广应用的抗除草剂的大豆、抗棉铃虫的棉花等。通过转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶；克隆动物的成功，可以挽救濒危的稀有动物。 基因工程在医学上主要是用于遗传疾病的诊断、基因的治疗方面。 基因工程具有巨大和广泛的发展前景，将渗透到人类生活的各个方面。可以创造出营养价值更高、保健作用更好、抗逆性更强的植物种类；转基因动物的进展，可以生产出多种类的用于人类遗传性疾病治疗的药物；人类基因组计划的完成和基因定位的发展、尤其是核酸分子杂交原理和方法与半导体技术结合而发展起来的DNA芯片技术的出现和完善，将在人类遗传疾病的诊断和治疗等方面发挥重要作用。 |
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