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一、拟南芥播种
种子装入dorf管内，20μl种子加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；
吸去乙醇，加入1ml 50%次氯酸钠：50%无菌水：0.05%吐温（or 5%漂白粉），震荡洗涤15-20分钟；
稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠或漂白粉，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；
将种子用接种环均匀铺于MS培养基上，用封口膜封口，放入4℃冰箱内冷处理2-3天（春化）。
MS培养基的用量：直径为9cm的培养皿用25ml，直径为6cm的培养皿用12.5ml。
加培养基时先将凝固的培养基用微波炉高温5分钟左右至全部解冻，然后慢慢冷却至不太烫手时倒板，如要加潮霉素等抗生素也是在此次加，加入后摇匀然后倒板。倒板后至自然冷却即可铺种，如水分较多或板不够硬，亦可于倒板后将培养皿盖打开晾10分钟左右（此时超净台要关闭）。
种子的杀菌、清洗、铺板等过程在超净工作台上无菌操作，操作者进入超净工作台要用酒精棉球擦拭手、器具、超净台，防止感染细菌、真菌。
二、MS固体培养基制备
1．培养基母液的配制和保存
MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50
mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。
大量元素(母液Ⅰ，20×) mg／L
NH4NO3
33 000
KNO3
38 000
CaCl2·2H2O
8 800
MgSO4·7H2O
7 400
KH2PO4
3 400
微量元素(母液Ⅱ，200×)
mg／L
KI
166
H3BO3
1 240
MnSO4·4H2O
4
460
ZnSO4·7H2O
1 720
Na2MoO4·2H2O
50
CuSO4·5H2O
5
CoCl2·6H2O
5
铁盐(母液Ⅲ，200×)
mg／L
FeSO4·7H2O
5 560
Na2-EDTA·2H2O
7 460
有机成分(母液Ⅳ，200×)
mg／L
ⅣA
肌醇
20 000
ⅣB
烟酸
100
盐酸吡哆醇(维生素B6) 100
盐酸硫胺素(维生素B1) 100
甘氨酸
400
上述几种母液都要单独配成1
L的贮备液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1
L。
母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450
mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。
各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。
2．配制培养液
用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。
配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。
3．溶化琼脂
用粗天平分别称取琼脂粉8 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750
mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000
mL，搅拌均匀。
需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。
4．调pH
用滴管吸取物质的量浓度为1
mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8，因高温灭菌时pH会下降，所以灭菌前通常pH配成6.2左右)。
5.培养基的分装
溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 mL或100
mL)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的3/5～4/5(我们每次通常用500ml的锥形瓶装400ml培养基，每次配4000ml培养基，用10个锥形瓶分装)。
培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。用2块硫酸纸(每块大小约为9 cm×9
cm)中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。
6．高压灭菌
培养基的高压灭菌包括以下几个步骤。
第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。
第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶(以上物品都要用牛皮纸封口)，用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。
第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121.3 ℃下，灭菌20 min。
灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用。
三、拟南芥的种植
1．人工土配制
18份蛭石，6份黑土和1份珍珠岩混合均匀，分装于塑料灭菌袋内，扎好口，于98 kPa、121.3 ℃下，灭菌40
min。冷却后备用。
有时也用两种土，即上层用不含黑土的人工土，下层用上面所讲的土。我估计原因可能有二：一是黑土容易生霉；二是黑土较难完全粉碎，较大的块状土不便于移栽。
2．PNS营养液：
每升含
5ml 1M
KNO3，
2ml 1M
Ca(NO3)2˙4H2O，
2ml 1M
MgSO4˙7H2O，
2.5ml
20mM Fe.EDTA，
2.5ml
1M磷酸缓冲液（pH5.5），
1ml 微量元素 。
注意：营养液用煮沸冷却后的凉开水配置。
PNS营养液母液配方：
①1M KNO3 101.1g
②1M Ca(NO3)2˙4H2O 236.15
g
③1M MgSO4˙7H2O，246.48
g
④20mM Fe.EDTA：
FeSO4 5.57g
EDTA 7.45g
注意先各自配成溶液，再混合。
⑤1M磷酸缓冲液（pH5.5）：
磷酸二氢钾 130.4g
磷酸氢二钾 9.12g
⑥微量元素
硼酸 0.434g
硫酸锰（MnSO4
H2O）
1.7626g
CuSO4˙H2O 0.0798g
ZnSO4˙7H2O 0.172g
NaMoO4˙2H2O
0.0432g
NaCl
0.585g
CoCl˙6H2O 0.00129g
以上母液均配至1L
3．种植步骤
种于MS培养基上的种子经春化后将培养皿取出置于组培室内，光照培养2周左右便可进行移栽。
移栽前先将灭过菌的人工土分装于塑料钵内（不要装满，否则不好盖保鲜膜），用喷壶浇入PNS营养液，将土浇透。塑料钵置于塑料托盘内，水要透过人工土注入托盘内，使托盘内有一层营养液。
移栽时选取生长较好的幼苗（2周左右的拟南芥幼苗常有2枚子叶和2张真叶，如潮霉素筛选时阴性苗不能长出正常的根和叶片），用镊子轻轻夹取拟南芥幼苗下胚轴处，慢慢将拟南芥的根从培养基中拔出（如根断了则丢弃），轻轻将根插入塑料钵内的人工土中，苗距2cm以上，密度视实验目的不同而异，如需收种子的，则密度不宜太大，否则种子太小不利后代繁殖。播完后用保鲜膜罩上，三天左右揭膜。以后的管理主要是浇浇水（开水冷却后浇于塑料托盘内，让人工土慢慢自行吸收）。
人工培养室条件：相对湿度80%，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8
h黑暗﹑16 h光照培养。
长日照条件下一般移栽后30-40天左右拟南芥即可开花。
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