【原】消毒与灭菌的方法及效果检查

         

一、消毒与灭菌的概念

　　在延期界中，微生物无处不有，无孔不入，如制种所用的原料、水、工具、设备、操作的双手和衣着以及空间，都有大量的微生物存在。因此要分离和培养食用菌纯种，首先必须将培养基进行灭菌达到灭菌状态，并对生产过程的各个环节以及环境也必须进行消毒，昼减少其它微生物的存活而造成生产的污染，因此消毒灭菌是菌种生产过程中必须掌握的最主要关键技术之一。

（一）消毒　具有杀死致病微生物的作用或方法，称为消毒。就食用菌菌种生产而言，消毒是指用物理或化学方法杀灭或消除对食用菌生长发育有害的微生物，通常只能消灭物体表面或环境中的一部分微生物，有能达到消灭所有微生物。

（二）灭菌　指彻底杀菌，即用物理或化学等方法，杀死物体上的一切微生物，以及它们的芽胞和孢子，使物体成为无菌状态。

二、常用消毒和灭菌方法

（一）物理灭菌方法　通过高潮、射线、微波以及器械进行灭菌或除菌的方法均为物理灭菌方法。

１、热力灭菌　利用高潮杀死微生物的方法，称为热力灭菌。微生物组成的最重要成份是蛋白质、核酸等，当高潮时会引起蛋白质和核酸不可逆的变性或凝固，使细胞失去了生理机能，停止生长发育，直至生化瓜停止而终止生命。此外高温尚可破坏细胞的　其他组成，或者使细胞的脂肪膜受热溶解而形成了极大的孔，导致细胞内含物泄漏而引起死亡，从而达到高潮灭菌的效果。

　　热力灭菌经常使用两个杀菌指数：热死温度和热死速度。前者指在１０分钟内可以杀死细菌悬液中所有细胞的温度，后者指在一定温度下，杀死所有细胞所需的时间。在同样温度条件下，热死温度高的微生物，其热死速度慢，热死温度低的微生物，其热死速度快。提高灭菌温度，可以加快热死速度。因此，可以通过提高灭菌温度来缩短灭菌时间，或延长灭菌时间以降低灭菌温度。

　　热力灭菌经济有效，简便易行，是最普遍采用的方法，它可以分为湿热灭菌和干热灭菌两种。

（１）湿热灭菌　指利用热蒸汽杀死微生物。由于蒸汽的穿透力较热空气强，蛋白质、原生质胶体在湿热条件下容易变性凝固，酶系统容易被破坏，蒸汽进入细胞内凝结成水，能放出潜在热量而提高温度，更增强了杀菌力。常用湿热灭菌方法圾如下几种。

A.高压蒸汽灭菌法 利用高温高压蒸汽进行灭菌的方法。高压蒸汽灭菌可以杀死一切微生物，包括细菌的芽孢，真菌的孢子或休眠体等耐高温的个体。灭菌的蒸汽温度随蒸汽压力增加而升高，增加蒸汽压力，灭菌的时间可以大大缩短。因此它是一种最有效的、使用最广泛的灭菌方法。

　　高压灭菌所采用的蒸汽压力与灭菌时间，应根据具体灭菌物质而定。液体培养基灭菌时，一般采用1.0Kg/cm2,温度121.30℃,灭菌30分钟;母种、栽培种等固体培养基灭菌时，通常采用1.5Kg/cm2,温度129℃,灭菌1-2.5小时。但有些固体培养基导热性差，培养基中耐热性微生物又较多，如制备蘑菇栽培种的河泥烘料培养基，灭菌时间或灭菌压力要有所增加，通常压力为2Kg/cm2,灭菌时间为4小时。

　　使用高压蒸汽灭菌时，应注意以下几点：

　　ａ、灭菌锅内的冷气必须排尽。冷空气的热膨胀系数大，若无菌锅内留有冷空气，当灭菌锅密闭加热时，冷空气受热很快膨胀，使压力上升，造成灭菌锅内压力与温度不一致，产生假性蒸汽压，锅内温度低于蒸汽压表示的相应的温度，致使灭菌有能彻底。特别是使用只装有压力表，没有温度表的灭菌锅时，尤应注意。

　　排除冷空气的方法有两种：缓慢排气和集中排气。缓慢排气法，即开始加热灭菌时便打开排气阀门，随灭菌锅内温度逐渐上升，锅内的冷空气便逐渐排出，当锅内温度上升到100℃,大量蒸汽从排气阀中排出时，即可关闭排气阀，进行升压灭菌。集中排气法，即在开始加热灭菌时，先关闭排气阀，当压力升到0.5Kg/cm2左右时，打开排气阀，集中排出空气，让压力降到零，并有大量蒸汽排出时，再关闭排气阀进行升压灭菌。固体培养基灭菌时可采用集中排气法。液体培养基灭菌时一般不宜采用，以免液体冲出瓶口

　　ｂ、灭菌锅内的培养基必须排列疏松，使蒸汽畅通。灭菌锅内蒸汽是否畅通，关系到灭菌温度是否均一。灭菌材料若放得过多、过密，会妨碍蒸汽的流通，影响温度分布的均一，造成局部地区温度较低，甚至形成温度“死角”，达不到彻底灭菌，常常导致以手杂菌污染。

　　ｃ、灭菌完毕，应缓慢减压。高压蒸汽灭菌结束后的排汽降压不能太快，若排汽太快，瓶内外的压力差　就会增大，引起瓶塞冲出瓶口；液体培养基灭菌时，液体会突然沸腾，弄脏瓶塞；塑料袋装培养料灭菌时，应让其自然冷却，当压力下降到0.5Kg/cm2左右时，再打开排气阀放气，以免在减压过程中，袋内外产生压力差，把塑料袋击穿，导致以后杂菌污染。

ｄ、注意棉塞防湿。用棉塞塞的瓶子或试管，在高压蒸汽灭菌锅中灭菌时，因锅中热蒸汽在锅壁四周和锅盖内侧容易产生凝结水，凝结水沿着锅壁和锅盖下流，弄湿棉塞。潮湿的棉塞在培养过程中，容易生长链孢霉等霉菌，污染培养物。为了防止棉塞潮湿，灭菌时，瓶子的棉塞不能接触灭菌锅壁，瓶子上面就盖铝帽或防水油纸，以免锅盖下面的水流到棉塞上。灭菌结束时，应先排放锅内热水，然后再慢慢排放蒸汽降压。若棉塞潮湿，可在锅中烘烤一定时间再取出来。

B.常压蒸汽灭菌法　采用自然压力的蒸汽进行灭菌的方法。阿诺氏(Arnold)流通蒸汽灭菌器是微生物技术中常用的设备。我国食用菌菌种生产过程中，有的利用蒸笼灭菌，有的利用钢筋水泥砌成大型的流通蒸汽灭菌灶，一次可灭菌几千瓶母种或栽培种培养料。

　　利用常压蒸汽灭菌时，灭菌物品在灭菌锅内排列不能过密，要保证蒸汽能在锅内均匀地流通。流通蒸汽的温度一般为100℃左右，要杀死耐热性的芽胞， 必须延长灭菌时间，一般为6-8小时。这种专用流通蒸汽灭菌灶的最大优点是：容量大， 结构简单，成本低廉，可自行建造。缺点是灭菌时间长，能源消耗量大，稍不注意就有灭菌不彻底的现象发生。

C.间歇灭菌法　指间歇一定时间，连续消毒几次达到灭菌的方法。此方法运用于不耐高温的(100℃左右)培养基的灭菌。欲杀死培养基的芽胞， 可将其在流通蒸汽中消毒20-30分钟,先杀死其中的营养体细胞,然后将培养基在室温或温箱中培养,使芽孢发芽长成营养体,再用流通蒸汽消毒20-30分钟,杀死新长成的营养体细胞,这样连续3次,即可杀死培养基中的全部芽孢,达到无菌状态。

（２）干热灭菌　采用灼烧或干热空气灭菌，称为干热灭菌。虽然干燥主热空气的穿透力不如湿热蒸汽强，但它使用方便，适用于玻璃器皿和瓷器等物的灭菌，故广泛应用于实验室和生产实践。干热灭菌主要有两种类型。

A.火焰灭菌法 即通过火焰高温灼烧进行灭菌的方法。耐热的接种环、接种铲、接种匙、接种针等，通过火焰灼烧，可彻底灭菌，试管口和玻璃瓶口，通过几次火焰，温度可达200℃以上，一切微生物和芽孢，可全部杀死，达到无菌程度。

B.干热灭菌法　即利用加热的高温空气进行灭菌的方法。干热烤箱是干热灭菌的常用仪器，它是通过电热丝进行加温和调温的，不仅可以用来灭菌，也可用于器皿等材料的烘干。干热灭菌适用于固体材料灭菌，不适用于液体材料灭菌。由于干热空气穿透力　差，加之微生物蛋白质在干燥条件下，不易凝固变质，故干热灭菌温度，一般要求掌握在160℃,维持2小时。但要注意，如果干热灭菌温度超过170℃,包装灭菌用品的纸张或棉花布类,会被热空气烤焦，甚至有着火燃烧的危险。

２、辐射灭菌　利用辐射产生的能量进行杀菌的方法，称之辐射灭菌。生产上应用辐射灭菌方法主要是指此外线灭菌。

　　紫外线灭菌　紫外线是非电离辐射，波长为136-400纳米，以波长265-266纳米的杀菌为最强。微生物细胞中的核酸碱基对紫外线吸收能力特强，辐射后引起核酸的突变，从而抑制DNA的复制而致死；与此同时， 空气在的一部分氧在紫外线照射下产生臭氧，也具有很强的杀菌作用。另外，紫外线照射微生物细胞后，在有氧的情况下，产生光化学氧化反应，生成过氧化氢(H2O2),能发生强烈氧化作用， 引起细胞死亡而达到杀菌目的。由于紫外线穿透物质的能力很差，一层普通玻璃或水，均能滤去大量的紫外线，所以只适用于空气和物体表面的灭菌，一般要求紫外灯距离照射物不超过1.0米为宜，接种室和接种箱常用紫外灯作为空气和桌面的消毒。

３、过滤除菌　是利用机械的阻留方法来除去介质中的微生物。在菌种生产上应用的设备主要有超净工作台和空气自净器，它们均恬于空气过滤除菌，超净工作台主要是使操作台面达到局部灭菌，而空气自净器是使接种室的空气经过过滤达到整个空间的无菌状态。

（二）化学灭菌方法

　　利用化学药品灭菌或创造一个无菌环境，也是非常重要的灭菌手段。许多公演药品可使菌体蛋白质变性，有的可阻碍微生物的某一代谢环节。因此，化学药品可超到杀菌作用或抑菌作用。直接加入培养基能起灭菌作用，又不影响培养基成分的化学药品并不多，根据报道β－丙烷内酯(BPL)和焦碳酸二乙酯(PKE)具有这种作用，但应用甚少。有的具有杀菌和抑菌作用，但加入培养基后阻碍了香菇菌丝体生长发育，也不能被采用。香菇生产中常用的化学药品及具体使用方法如下。

１、甲醛的杀菌机理是具有强还原作用。甲醛与微生物蛋白质（含蛋白酶）的氨基结合，使蛋白质变性。其反应式为：蛋白－氨基＋甲醛（气体）→蛋白－氨基、甲醛。甲醛溶液杀菌力比石碳酸强，1:200的甲醛溶液在6-12 小时内可杀死所有的细菌芽孢;并对真菌孢子及营养体均有极强的杀伤力,不受有机物质的影响。因为它具有腐蚀性,刺激性大,不宜人体使用。常用福尔马林消毒空罐、无菌室或无菌箱等。

　　使用方法有加热熏蒸法，即利用福尔马林沸点96!0的特点，将福尔马林置于玻璃、陶瓷或金属容器中，用酒精灯或电炉加热，药液蒸发完，立即撤去热源。

　　加高锰酸钾氧化剂熏蒸法，即甲醛是还原剂，故与氧化剂反应可产生大量热。这种热又将蓁甲醛挥发。具体做法是在坩锅内（或用培养皿），按每立方米体积加10毫升福尔马林与1.5克高锰酸钾的比例计量,任其甲醛挥发, 关好门窗闷一夜或更长时间,能够达到良好的熏蒸灭菌目的。熏蒸后，室内不断散发刺激鼻眼的臭味。有必要驱除室内甲醛气味时，可向室内喷洒氨水，氨水浓度为25-28%, 喷的雾滴越小越好,喷氨水的量为熏蒸甲醛的一半,约30分钟左右,氨水与空气中残存甲醛结合,形成白色无臭粉末。如无氨水，可用氯化铵或硫酸铵加石灰水产生氨气来中和甲醛。铵盐用量每立方米空间为5-6克。

２、硫磺及其熏蒸灭菌方法　商品硫磺为有光泽的淡黄色粉末（或碎块），不溶于水，熔点为363℃,燃烧后生成二氧化硫。二氧化硫为无色气体，有刺激味，渗透力强，易溶于水，生成亚硫酸，有助于提高灭菌率，同时可杀虫、杀螨。

　　使用方法是按每立方米空间15-20克计量,将硫磺放置在离地面较高的瓷或金属容器中，点燃硫磺产生二氧化硫，二氧化硫的密度比空气大，很容易下沉，所以一定要注意将装硫磺的容器放在空间较高的位置。为提高灭菌效果，在熏蒸前，应先向空间及墙壁上喷少量水雾，有助于增加二氧化硫与生成亚硫酸，从而提高熏蒸灭菌效果。

　　硫磺点燃后，对人体呼吸道粘膜、眼结膜有刺激性，应注意防护。二氧化硫对纤维及金属物品有腐蚀作用，因此，熏蒸房屋时应撤出易腐蚀物品。

　　除熏蒸与内吸外，其他化学灭菌方法均可归纳为表面灭菌。它们对微生物的毒害作用主要是迅速使细胞表面蛋白质、核酸及有关酶类被破坏。

３、乙醇类　乙醇又称为酒精。70-80%乙醇的杀菌能力较强。高浓度乙醇杀菌能力反而降低，因为95-100%的乙醇具有很强的脱水作用,当遇到微生物细胞时, 细胞表面很快脱水形成一层保护膜,乙醇分子再不易渗透保护膜起到杀菌作用。如乙醇中加入稀酸或稀碱，杀菌效力增强。在70%乙醇中加1%硫酸或氢氧化钠,可在1-2 天内杀死枯草杆菌芽孢。乙醇只会杀死细菌营养体，在香菇生产中，多用于接种时手的皮肤及器械杀菌。使用时，对表面干燥的物品，用70-75%的乙醇擦拭；对于表面略湿润的物品多采用85%乙醇消毒。乙醇能降低酚、甲醛等杀菌能力， 但能增强硫横及升汞的杀菌效力。

４、酚及其衍生物　常用的是石碳酸，又名苯酚，纯品为无色或白色针状、块状或三棱形晶体，溶于水，具特殊气味。浓石碳酸能使皮肤变白、手指麻痹并可损坏皮肤与粘膜，对人畜有毒。0.5-1%的石碳酸水溶液作为喷雾剂处理无菌室(箱), 能起到降尘除菌、空气消毒的作用；也可用3-5%的石碳酸水溶液对器械浸泡消毒。在5%石碳酸水溶液中若加入0.85-0.9%的食盐则可增加石碳酸药效,如有乙醇存在时, 则药效大减。

　　石碳酸杀菌原理是使细菌蛋白质变性，也具有表面活性剂作用，破坏细胞膜的透性，可合细胞内含物外溢。石碳酸水溶液浓度大时是致死因子；反之，则起抑菌作用。

　　甲酚是酚的衍生物，又名来苏尔（煤皂酚），是用肥皂乳化的甲酚，杀菌效力比苯酚大４倍，常用3-5%的溶液消毒皮肤、桌面及用具。

５、石灰与碱类　石灰分为生石灰(CaO)与熟石灰(Ca(OH)2)两种。起杀菌作用的是熟石灰中的氢氧根离子，能水解蛋白质和核酸，使微生物的酶系和结构受到损害，并能分解菌体中的糖类。

　　使用生石灰时应加水，或生石灰遇到潮湿的物体，均会生成熟石灰，其化学反应式为：CaO+H2O→Ca(OH)2+热量。如果熟石灰长时间曝露在空气中， 可能使熟石灰吸收空气中的二氧化碳而生成有能杀菌的碳酸钙，反应式为：Ca( OH) 2+ CO2→CaCO3+H2O

从反应式中可清楚地看到，如想灭菌只能用生石灰使其与水反应生成熟石灰而杀菌。一般1-3%石灰水就可起很好的杀菌作用。如用0.5%石灰水浸泡稻草２小时或更长时间，也可起到杀菌与软化纤维的作用。菌筒或菌砖上发现霉菌污染时，也可将生石灰直接撒到污染菌面上，杀菌效果良好。

６、氧化剂与还原剂　高锰酸钾、过氧化氢、卤素（氯、溴、碘）及某些化合物（或络合物），如漂白粉等均为氧化剂，可以杀菌。亚硫酸及亚硫酸盐等均为还原剂，能通过氧化还原反应起到杀菌作用。

（１）高锰酸钾　强氧化剂，1:1000与1:1250的浓度都具有杀菌作用。0.5-1%的高锰酸钾水溶液于５分钟内可杀死大多数细菌；５％水溶液于１小时内可杀死细菌芽孢。高锰酸钾在酸性溶液中杀菌作用增高，如用１％高锰酸钾和１％盐酸溶液能在30分钟内破坏炭疽芽孢。高锰酸钾遇有机物时被还原成无杀菌作用的二氧化锰。因此，有能用于直接拌料灭菌。高锰酸钾对霉菌杀伤效果很差。

　　高锰酸钾只局限于对皮肤、粘膜及玻璃器皿消毒用，绝不能用于香菇生产原料（木屑等纤维材料）的直接拌料灭菌。

（２）碘及其化合物（络合物）　3-7%碘溶于70-83%的乙醇中所配制的碘酊, 是皮肤及小伤口的有效消毒剂。5%与10%碘化钾水溶液也是皮肤有效的消毒剂。有机碘化物如碘福具有良好杀菌作用，有仅能杀死一般的细菌和真菌，并可使病毒灭活。

（３）漂白粉及其使用方法　漂白粉（氯石灰）是白色粒状粉末，能溶于水，易生成沉淀。高效漂白粉的有效氯含量为40-80%。漂白粉的使用浓度为５％，通常按每立方米空间用１克高效漂白粉计量。使用时将１克高效漂白粉溶于１升水中，静放１小时左右，取其上清液喷雾灭菌。

　　漂白粉的杀菌原理是漂白粉溶于水后，生成次氯酸和次氯酸盐等，并能释放氧，使细菌蛋白质或酶发生氧化；同时，释放出的氯还能取代蛋白质氨基中的氢离子使蛋白质变性，从而杀灭微生物。

７、重金属类　一些重金属及其化合物，可使微生物的蛋白合成受破坏，亦可导致酶失活及取代细胞结构上的主要元素，使微生物生长受掏或导致死亡。

　　常用的表面消毒剂是二氯化示，又名升汞。1:500-1:2000的升汞溶液对多数细菌有匀菌作用。由于升汞对金属器皿有腐蚀作用，对人畜有剧毒，目前又合成了对人体低毒的硫柳汞、袂塔酚(metaphen)等。

　　在香菇生产中常用的硫酸铜也是防治真菌的良好消毒剂，使用浓度低于２％，喷洒物体表面，主要防治青霉类真菌。如将硫酸铜、石灰、水，按1:1:100 的比例所配制成的波尔多深夜，是菇房、床面等的良好表面消毒剂。

８、表面活性剂　具有降低表面张力的物质称为表面活性剂。常用的肥皂与十二烷基磺酸钠类（如洗衣粉）的杀菌能力相当于石碳酸的2-3倍。

　　市售的新洁尔灭是季胺盐类的表面活性剂。化学名称为十二烷基溴化胺，淡黄色，有香味的胶状体。一般可将原液(5%)稀释一倍，把器械或手、以及不能遇热的器具进行消毒。对细菌、病毒有较好的杀灭能力，但对真菌杀灭效果不好。经常使用新洁尔灭会使皮肤干裂，同时对粘膜有刺激性，对铝制品有腐蚀性，对橡胶没有消毒作用。因此，不能用新洁尔灭消毒胶塞进行担子菌菌种保藏。

　　表面活性剂的杀菌机理是改变细胞透性，使菌全破裂；聚集在菌体表面时，影响细胞代谢，破坏细胞蛋白与酶的活性。

三、消毒与灭菌效果的检查

　　消毒与灭菌效果好坏，直接关系到菌种成品率的高低。因此，除了要严格把好消毒、灭菌关外，同时还要严格执行检验制度，两者缺一不可。

（一）培养基灭菌效果检验

１、试管母种培养基经灭菌后，从高压灭菌锅中不同部位随机抽取５支，放置28±2℃恒温箱中培养5-7天,如无霉菌、细菌、酵母等杂菌出现，则认为灭菌彻底。

２、原种及栽培种培养基经灭菌后，从灭菌锅中上、中、下三层进行取样，每层对角线随机取样５瓶（袋），放置28-30℃恒温培养箱中培养5-7天，检查是否有霉菌菌落生成。如检查是否有细菌没有杀死，必须使用细菌培养基进行检测。细菌培养基：称取牛肉浸膏(或牛肉汁)10克,蛋白胨10克,NaCl15克,琼脂粉14 克, 加蒸馏水1000ml,经加热溶解后,装入试管中,在121℃条件下灭菌15分钟,随后排成斜面试管。上述抽取的样品，分别在无菌下取出少量培养基接入细菌培养基，然后在37℃培养24小时，检查结果没有细菌菌落产生，说明灭菌彻底。如某一位置试样出现杂菌，可能是锅内有“死角”，也可能是灭菌锅结构不合理，或没有按操作要求堆积，　气撒料，或一次性撒料过厚，或菌种瓶、袋过于拥挤，蒸汽流通不均匀造成；如不分部位，大部分或几乎全部瓶、袋都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，如果是高压灭菌锅出现这种现象，则说明是冷窑没有排除干净所致。

（二）接种室（无菌室）、箱灭菌效果检验方法

１、平皿法　先制作常任的霉菌培养基，如CPDA、PDA、BSA等，灭菌后，常规制作无菌平皿培养基（简称平板）。检查接种室（箱）灭菌合格与否，随机取几组无菌平皿培养基（每组3-5个平皿）在接种室（箱）台面上不同位置打开置放的平皿， 其中一组不打开平皿盖作为对照，开盖平皿放置５分钟，然后盖上盖，与对照组同时在30℃培养72小时,检查在平皿培养基上是否有霉菌菌落。实验组少于１个菌落，视为灭菌合格。

　　检查细菌方法同上，一般采用MPSA培养基。不同的是将实验的平皿均放置在37℃下培养24小时,至多不超过48小时。

２、试管法　将上述常规真菌与细菌培养基斜面各取3-5支为一组,放置接种室(箱)内,按无菌操作将其中实验组棉塞打开,经30分钟后,再将无菌棉塞塞好,与对照组同时放在30℃和37℃进行(细菌与霉菌)培养。细菌在培养24-28小时后观察， 霉菌在培养72小时后观察,实验组均不长任何菌落,视接种室、箱灭菌良好。