黄连素降糖量效关系实验研究概述

黄连素降糖量效关系实验研究概述

近20多年，越来越多的研究显示 ，黄连素(即盐酸小檗碱，BBR)具有确切的降糖作用；且黄连素在一定的给药剂量或浓度范围内具有量效关系。本文从黄连素对整体动物及细胞降糖的量效研究角度进行综述。

基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划)(2010CB530601)

作者单位：100053北京，中国中医科学院广安门医院内分泌科[袁名泽(硕士研究生)、刘桂芳、张家成(硕士研究生)、姬航宇(博士研究生)、赵林华、周强(博士研究生)、仝小林、李敏]；北京中医药大学针灸推拿学院[袁名泽(硕士研究生)、张家成(硕士研究生)]

作者简介：袁名泽(1985一)，在读硕士研究生。研究方向：中西医结合糖尿病的基础与临床。E-mail：[e-mail]

通讯作者：李敏(1972一)，女，博士，研究员。研究方向：中西医结合糖尿病。E-mail：[e-mail]

1.黄连素对整体动物血糖的量效研究

传统观念认为，黄连素口服吸收差，在胃肠道吸收不好；小鼠静脉注射黄连素，在体内吸收快、分布广泛。黄连素静脉给药后5分钟到2小时小鼠各组织中分布顺序：肺>肝>脾>肾>心>肠>胃≥脑；小檗碱主要经过尿中排泄，粪排泄很少，且存在肝肠循环。

1.1黄连素对正常动物血糖的量效研究

黄连素对正常动物空腹血糖的影响存在争议，其量效研究也较少。早期，陈其明﹡发现黄连素能降低正常小鼠的空腹血糖，另有研究也肯定了这个观点，黄连素剂量50 mg／kg具有降糖作用，而25 mg／kg没有降糖效果；但也有相反的观点，如李应霞﹡采用正常Wistar大鼠为模型，以不同剂量黄连素(60、40、30 mg/kg，注：30 mg约10 p,mol，下同)干预21天，对血糖没有影响。

不同剂量黄连素干预后，正常动物没有出现低血糖现象，说明黄连素对正常人可能具有较大的安全性。

1.2黄连素对糖尿病大鼠血糖的量效研究

1.2.1黄连素对l型糖尿病动物血糖的量效研究

l型糖尿病多采用不同浓度的高剂量四氧嘧啶造模，研究者以不同剂量黄连素对其干预。结果显示，黄连素对1型糖尿病动物的降糖作用具有剂量依赖性，且其有效范围为40 mg／kg到120 mg／kg之间，随着剂量的增加，降糖作用越强。如陈远航﹡以1型糖尿病小鼠模型(100mgkg四氧嘧啶造模)，以不同剂量黄连素(40、80、120 mg／kg)灌胃10天，其降糖及提高血清胰岛素作用具有剂量依赖性，高剂量(120 mg/kg)作用最强。李应霞﹡以雄性Wistar大鼠(皮下注射四氧嘧啶200 mg／kg造模)，以不同剂量黄连素(60、40、30 mg／kg)灌胃，也得到同样的结论。Chueh WH等以不同剂量黄连素(50、150、500 mgk)灌胃14周，胰岛数量增加具有剂量依赖性。而另有研究示对胰岛素基因敲除的小鼠(NOD／LtJ小鼠)灌胃黄连素(100、200 mg／kg)，无降糖效果。

黄连素的时效方面，陈其明[7’以50 m∥蝇黄连素的剂量灌胃l型糖尿病大鼠(尾静脉注射四氧嘧啶95—100 mg/kg)，第l、4、10天均可降低血糖。说明黄连素在50 mgb灌胃时具有至少10天的稳定的降血糖作用。

1.2.2黄连素对2型糖尿病动物血糖的量效研究

黄连素可确切地降低2型糖尿病模型动物的血糖，在40～200 mg／kg效果明显，且呈量效关系，黄连素剂量越大，降糖效果越明显。Wang Y等‘。’以2型糖尿病大鼠为模型(sD大鼠，高热量饲料加35 mg／kg链脲佐菌素腹腔注射)，以不同剂量黄连素(50、100、150 mg／kg连续灌胃6周)，结果示剂量为100 mgkg及150 mg／kg黄连素均显著降低大鼠空腹及餐后血糖，而50 mgkg黄连素对血糖无明显影响，不同剂量均对血清胰岛素、瘦素、脂联素无明显影响。有研究采用2型糖尿病大鼠(高脂饲料+链脲佐菌素50 mg腹腔注射)以不同剂量黄连素(75、150 mg／kg)灌胃，结论与上述研究一致。

此外，剂量不同，降糖作用出现的时间也存在差异，剂量高的黄连素组出现明显降糖所用的时间比剂量低的组短。如张彦﹡以不同剂量黄连素(50 mg／kg和25 mg／kg)连续15天灌胃2型糖尿病大鼠(四氧嘧啶45 mg／kg)，前者于给药后第6天、后者第9天均呈现明显的降糖作用。

肠促胰岛素因其独特的降糖作用，成为近年的热点。肠促胰岛素通过多种途径降糖，与中药的多靶点降糖的特点相似。黄连素可能通过诱导GLP-1释放来间接促进胰岛B细胞分泌胰岛素，从而降低血糖。如吕秋菊﹡首次观察黄连素对2型糖尿病大鼠(未指明具体造模过程、体重)血清GLP-1的影响。以不同浓度黄连素(15 mg只及30 mg只)干预。结果两组黄连素均能有效刺激GLP-1分泌，且呈明显量效关系：在各个时间点(灌胃后O、15、30、60及120分钟)，30 mg只的组刺激作用明显优于15 mg／只的组。

2.黄连素对细胞模型降糖作用的量效研究

2.1黄连素作用于肝细胞的量效关系

肝脏通过参与糖原分解和糖异生调节血糖浓度，肝细胞系HepG2常用来研究药物的糖耗量。黄连素干预肝细胞系HepG2细胞，存在一定的量效关系。殷峻等﹡ 以黄连素的有效浓度20 tzmol／L干预肝细胞系HepG2。发现在中糖浓度(11.1 mmol／L)时，黄连素具有降糖作用，糖耗量增加51％，而在高糖浓度(22.2 mmol／L)没有降糖作用。其进一步研究以不同浓度黄连素(1.O、5、10、50、1∞Ixmol／L)干预HepG2，结果示黄连素浓度在5 Ixmol／L~100

Ixmol／L时具有显著的降糖作用，可使培养液中的葡萄糖消耗量增加32％一60％(P<0.001)，但没有量效关系，同时随着浓度增加，显著抑制HepG2细胞的增殖；黄连素浓度降至1 txmol／L降糖作用消失。常伟等﹡进一步探讨其机制，以不同浓度黄连素(1、3、10、30、100 Ixmol／L)处理HepG2细胞24小时后，胰岛素诱导基因2(Insig-2)和维生素D受体(VDR)基因表达上调，其效应随药物浓度的升高而逐渐增强，浓度为3 txmol／L时达高峰，随后则逐渐减弱。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是葡萄糖代谢的关键酶。Ge Y等﹡以不同浓度黄连素(1、lO、25、50 p.mol／L)培养大鼠原代肝细胞(sD、zF、zL大鼠)，均剂量依赖性的增加磷酸化的AMPK-ot，及底物乙酰辅酶A羧化酶，但对AMPK-B亚基没有量效关系。

2.2黄连素作用于脂肪组织细胞的量效关系脂肪组织也是机体能量调节重要器官，在糖尿病发病中起重要作用，脂肪细胞系313.Ll常用来研究糖代谢。周丽斌将3T3-L1细胞在25 mmol／L葡萄糖培养液中孵育24小时，以不同浓度黄连素(0.1、l、5、10、50、100、200 I~mol／L)干预，浓度在0.1～200 txmol／L之间呈量效关系，其葡萄糖消耗量增加26％～201％。郭晓农﹡也观察到黄连素浓度在0.3到30 mg／L之间(即0.1至10 Ixmol／L)对3T3L1前脂肪细胞的葡萄糖消耗具有明显的量效关系。这与殷峻﹡ 的研究结果不一致，其研究示黄连素在高糖浓度(22.2 mmol／L)下没有降糖作用，可能是因为两者的模型不同(3T3L1与HepG2)。葡萄糖转运实验结果显示，以不同浓度黄连素(O.1、1、lO、50、100、200 txmo]／L)干预，结果示黄连素浓度在0.1-10 la,moL／L之间的葡萄糖转运效果显著增加，但黄连素剂量达到50 I~mol／L时葡萄糖转运效果显著降低。这与模型细胞的活力在此浓度降低的结果一致，可能是黄连素对脂肪细胞产生毒性作用进而抑制了葡萄糖转运，但此时糖耗量却没有相应的减少，反而随黄连素浓度的升高而增加，可能黄连素具有其他降糖机制抵消了细胞毒作用引起的降糖效果。葡萄糖转运的时效研究结果显示，10 I~mol／L黄连素温育2小时即可使葡萄糖转运率增加43％，6小时时增加59％，12小时时增加101％，24小时和48小时时分别增加112％和127％，说明12小时时黄连素的作用已趋近最大。在最佳浓度下，黄连素对脂肪细胞模型(3T3L1)的降糖作用具有不同于胰岛素的时一效特点，其作用远不如胰岛素迅速，可能在于其促进葡萄糖转运的机制与胰岛素不同。

2.3黄连素在肌肉组织降糖的量效关系

L6肌管细胞(1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200 0,mol／L)培养细胞，剂量依赖性的减少PPAR-3,和FAT／CD36蛋白表达。对在体的比目鱼肌也具有量效关系，剂量依赖性的激活AMPK催化亚基的a1、a苏氨酸磷酸化。剂量依赖性的促进线粒体呼吸﹡(0、2、4、6、8、10 la,mol／L)。

2.4黄连素作用于胰岛细胞的量效关系

胰岛细胞分泌胰岛素调节血糖，细胞系BTC3能稳定分泌胰岛素。殷峻等﹡观察到不同浓度黄连素(O、O.0l、0.1、1.O txmol／L)均对B细胞无胰岛素促泌作用，而且1.O i~mol／L的黄连素显著抑制了胰岛素的分泌(P<0.01)，其原因可能在于该药阻滞了BTC3细胞的增殖。

黄连素能部分预防和拮抗链脲菌素所致胰岛B细胞损伤，呈剂量依赖性。李素迎等﹡以不同浓度黄连素(10、20、40、80 ixmol／L)干预以上离体细胞，结果示浓度高(40、80o,mol／L)的黄连素干预组的1小时高浓度葡萄糖刺激的胰岛素(HGSIR)高于单纯STZ组但均明显低于正常对照组，且呈剂量依赖性：浓度越高，预防和拮抗链脲菌素所致胰岛B细胞损伤的作用显著。

以不同浓度的黄连素(1、3、10和30~moL／L)干预离体胰岛细胞，黄连素浓度依赖性增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌，浓度越高，作用越明显。

2.5黄连素作用于肠道细胞的量效关系

肠道葡萄糖的吸收对调节血糖具有重要作用，Caco-2细胞模型可用来研究黄连素对二糖水解的影响。潘国宇﹡以不同浓度黄连素(0.02、0.2、2、20 mg／L)干预以上模型40分钟，黄连素对蔗糖的抑制作用存在量效关系，对麦芽糖的抑制作用虽然显著，但是量效关系不明显。在体肠灌流模型研究表明，50 ixmoL／L黄连素，在肠道内几乎不吸收(2.5小时吸收量小于5％)；黄连素的降血糖作用可能并不是在它吸收之后产生的，而是象阿卡波糖等a2糖苷酶抑制剂一样在肠道发挥作用：黄连素降血糖机制可能主要是通过抑制蔗糖酶、麦芽糖酶等二糖酶活力，减少葡萄糖吸收，降低餐后高血糖的产生。有研究考虑其吸收过低、剂量过高(有的达3g／天)的局限性，而对BBR结构进行修饰，发现其8位羟基取代化合物(BBRH)对2型糖尿病模型大鼠疗效均显著优于BBR组，且剂量较BBR低1个数量级L26 J。此外，NCI-H716系肠内分泌细胞株，常用来研究GLP—1分泌的调节。研究黄连素0、1、10、100 la,mol／L预处理，浓度依赖性刺激GLP-1释放[从基础的(O.34±0.02)pM／mg到100 txmoL／L的(0.51±0.03)pM／mg l¨“。

2.6黄连素作用与不同细胞模型的量一效一毒关系分析

不同的模型细胞，黄连素发挥细胞毒性作用的浓度也不同。肝细胞系HepG2出现毒性的黄连素浓度较低(t>3 l~mol／L)，说明黄连素降糖的同时，也具有肝毒性，可能是造成其浓度在5～100~mol／L时没有量效关系的原因。对脂肪细胞系3T3一L1，黄连素的细胞抑制作用的浓度在10到50 I~moL／L之间。而对胰岛细胞系BTC3的细胞毒性作用的浓度更低，为1.0 I~mol／L，但是临床不仅未见黄连素的毒性报道，而且有研究显示黄连素对肝源性的糖尿病具有肝保护作用，可能与黄连素的体内变化有关，如黄连素血药浓度低或转化为其他物质等；也可能是黄连素在不同的器官分布的浓度不同所致。

3.讨论

综观以上黄连素降糖的量效关系研究，得出以下结论：(1)黄连素的治疗窗：黄连素给药剂量大于40 m、kg具有明显降糖作用，且剂量在40～200mg／kg之间存在量效关系；适合中等浓度的血糖(11.0 mmol／L)；在高糖浓度(大于22.O mmol／L)血糖中，黄连素没有降糖作用。(2)黄连素的量毒关系：随着黄连素浓度的增大，出现明显的肝毒性，对脂肪细胞也具有抑制作用。(3)黄连素的吸收：黄连素的降血糖作用可能并不仅在其吸收人血之后产生，而可能早在肠道发挥作用。