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铜蓝蛋白（ceruloplasmin）是一种天蓝色α2 糖蛋白唾液酸酶，存在于所有脊椎动物血清中，主要在肝脏中合成，能结合体内 95% 以上的铜，1948 年由 Holmberg 等发现。目前，铜蓝蛋白基因的 cDNA 已被成功克隆，人类铜蓝蛋白基因也已被定位于 3q23-q24。人类铜蓝蛋白基因由 20 个外显子组成，长约 65kb。肝细胞内可以找到它的两个转录本，分别长为 3.7kb 和 4.2kb，但是翻译出来的单条多肽链总是由 1046 个氨基酸残基组成，这可能是由于在 3' 非翻译区存在一个可变的多腺苷酸化位点所致。 一直以来，铜蓝蛋白都被认为是铜的运送体，将铜金属从肝脏运输到其他不同的组织。然而，随着在人类的组织中陆续发现其他的铜运送蛋白，铜蓝蛋白作为运送铜的角色开始被质疑，而且研究者也已证明铜的代谢并不仅依赖于铜蓝蛋白。直到现在，铜蓝蛋白的功能还是没有被完整地发现和阐释，但它在铁代谢方面的重要作用已开始受到关注。 肝豆状核变性、Menke 综合征和遗传性低铜蓝蛋白血症（aceruloplasminemia）均可表现为血浆铜蓝蛋白降低。肝豆状核变性，又名 Wilson 病（WD），是最常见的血浆铜蓝蛋白降低的疾病。它属于一种常染色体隐性遗传病，基因已被克隆，称为 ATP7B，定位于 13q14.3（不在 3q），其编码的酶功能缺陷使肝细胞内的铜无法与前铜蓝蛋白（apo-CP）结合，也不能使铜通过肝小管排泌人胆道，导致铜在肝、脑等组织中沉积产生损害。由于 apo-CP 无法与铜结合，作为一个不稳定的蛋白，缺乏氧化活性，半衰期缩短，使其 mRNA 水平降低. 继发血浆铜蓝蛋白浓度下降，所以该病的本质是铜在机体器官中蓄积所导致，而并非铜蓝蛋白的缺乏。Menke 综合征是一种罕见的性连锁隐性遗传病，其候选基因 ATP7A 也已被克隆。该酶的缺陷使肠黏膜细胞中的铜不能转运至细胞间液或者入血，导致机体铜缺乏，继发结合型的铜蓝蛋白减少，故也可表现为血浆低铜蓝蛋白，但疾病的核心在于铜的缺乏，也并非铜蓝蛋白缺乏所致。而遗传性（既往命名为家族性）低铜蓝蛋白血症，也即本文所要讨论的核心，是由于编码铜蓝蛋白的基因变异所导致的血浆铜蓝蛋白减少，甚至缺乏。其临床表现包括：糖尿病、皮质下痴呆、构音障碍、齿轮状肌强直、肌张力障碍、舞蹈动作、步态共济失调、眼睑痉挛、视网膜变性等。此病患者肝铜浓度正常，但肝铁贮积增加，血清铁蛋白浓度明显增高。铁在胰腺及其他实质性脏器中浓度也增高，病理检查可见铁在胰岛沉积和 B 细胞的选择性丧失。头颅 MRI 可见大量铁盐沉积在基底节、丘脑和黑质等区域，脑组织在镜下可见小胶质细胞和神经元中有大量的铁沉积及选择性的神经元缺失。视网膜周边部存在铁离子的积聚和感光细胞的丧失。 目前在 WD 及 Menke 病的患者中观察铁代谢紊乱的资料还不多。通过检查患者血清铁蛋白浓度、胰岛功能、头颅 MRI、眼底检查以及肝脏活体组织检查，可以在上述疾病中鉴别出遗传性低铜蓝蛋白血症。但从近几年的临床实践中发现，与血浆铜蓝蛋白降低相关的疾病之间的鉴别仍十分困难，此类患者长期处于诊断不明状态，想要达到早期诊断，甚至在临床症状出现之前便早期鉴别，基因检查将是最有效率的方法。 一、基因突变导致铜蓝蛋白功能改变的 4 种机制 截至 2011 年 11 月，世界范围内已经报道在 60 多个不同的家族及患者中发现共 43 种铜蓝蛋白基因突变。铜蓝蛋白的合成需要完成两个重要步骤才能表现亚铁氧化酶活性：首先是与铜结合，然后是从内质网运送到高尔基体。如果任何一步出现问题都可以影响到酶的活性，最后导致铁在不同组织中沉积。 1. 第 1 种机制：通过对铜蓝蛋白氨基酸序列的分析，Hellman 等发现铜蓝蛋白的 G（FLI/LI）重复基序是铜蓝蛋白氨基酸正确折叠的关键，若基因突变影响到这一保守的重复基序，铜蓝蛋白将无法正确折叠，那么变异的铜蓝蛋白将停留在早期分泌途中，无法正常地从内质网运输到高尔基体。影响这一重复基序的基因突变包括 G873E、G176R 和 P177R。然而，Hellman 等同时也发现 G876A 突变的蛋白并没有滞留在内质网，尽管这个突变是位于重复基序的下方，但并没有影响铜蓝蛋白的转运，所以暗示了可能存在其他机制运输铜蓝蛋白。 此后 Kono 等通过对 3 个不同位点突变的研究，发现突变体含有半胱氨酸 -811（Cys-881），能够通过内质网而分泌，而不包括 Cys-881 的突变蛋白只能滞留在内质网，由此导致内质网压力，并最终导致细胞死亡。最近 Hida 等研究发现 W1017X 变异的铜蓝蛋白无法释放到介质中，此突变蛋白包含了完整的 G（FLI/LI）CP 折叠区域和 Cys-881，因此推测，从第 1017 个氨基酸赖氨酸到羧摹末端这一段对铜蓝蛋白的释放可能是必需的。 2. 第 2 种机制：包括 M966V、Q692K、G631R 和 G969S 等变异，这些变异蛋白有正常合成和分泌速度，但是无法与铜结合，以至于滞留在分泌的后期或者形成前体铜蓝蛋白而被运输出细胞外。根据研究，这些突变位点位于 Cu（I）结合位点的附近，错误的氨基酸替换导致结构缺失，使得蛋白无法与铜结合，而且这种结构缺失在体外也无法被 Cu（I）- 谷胱甘肽复合体重建。没有结合铜的 apo-Cl 是不稳定的，相对于全铜蓝蛋白（holo-CP）数天的寿命，apo-CP 在血浆中只能维持几小时就被降解，这也就可以解释为什么低铜蓝蛋白血症的患者几乎无法在血浆中检测到铜蓝蛋白。 3. 第 3 种机制：含有 Y356H、R701W 和 G876A 的突变蛋白可以被重建成 apo-CP 和 holo-CP，而且都能被成功运输，然而这些突变体却无法维持膜铁转运蛋白（ferroportin）在细胞表面的稳定，说明这些突变体丧失了亚铁氧化酶的活性。这个发现给我们呈现出第 3 种机制，即推测这种突变可能改变了铁的结合位点，从而影响了铜蓝蛋白的亚铁氧化酶活性。但这需要我们进一步分析变异体的晶体结构才能有力说明。 4. 第 4 种突变机制：影响铜蓝蛋白功能。由 di Patti 等提出，他们发现 D58H 和 R701W 突变体蛋白并没有丧失与铜结合的能力 [ 因为在体外能被 Cu（I）-GSH 复合体重建 ]，而且能被顺利运送，但却注意到将铜负载到蛋白上这一过程受到了损害。这一过程需要 ATP7B 编码的铜负载蛋白来完成。这一假说通过输入酵母菌的铜负载蛋白 Ccc2p（在酵母菌内表达的另一种铜负载工具），弥补了 ATP7B 铜负载的功能，出乎意料地使变异的铜蓝蛋白恢复亚铁氧化酶活性。由于 R701 位于铜蓝蛋白底部的一个平台区域，推测这一区域是 ATP7B 递送铜的区域，所以这个位点突变就会影响 ATP7B 的作用位置，从而造成 ATP7B 的“功能沉默”。 二、铜蓝蛋白对铁代谢的作用机制 对铁吸收的精准调控是控制体内铁动态平衡的关键环节。在没有应激的情况下，亚铁氧化酶 hephaestin 主要负责从肠腔促进铁的吸收，而铜蓝蛋白则负责促进铁从组织中释放，对于铁在消化道的吸收基本没有作用。然而 Cherukuri 等发现在应激状态下，要满足机体对铁的需求，并不是增加铁从组织中释放，而是增加铁从消化道的吸收。应激介导的铁吸收增加，是由于铜蓝蛋白从十二指肠上皮细胞的胞质转移至黏膜固有层下面，这样，铜蓝蛋白就能大大地促进铁从肠细胞基底外侧膜转出至绒毛内的毛细血管，以补充血清中的铁。在压力应激下，这两种相关的亚铁氧化酶（ceruloplasmin ＆ hephaestin）共同负责铁在消化道的吸收，由于这一铜蓝蛋白依赖的铁吸收途径明显增强，形成了一个保障机制，保证了铁的补充。 在铁的储存和利用方面，铜蓝蛋白也起到非常重要的作用。首先我们知道，膜铁转运蛋白是惟一的铁转运蛋白，它负责将铁从细胞内运送到血浆，因此，细胞表面膜铁转运蛋白的存在是调节血浆铁浓度的关键。而铜蓝蛋白负责将膜铁转运蛋白转运至胞外的 Fe2+ 氧化成 Fe2+，然后 Fe3+ 与转铁蛋白结合，被运送到其他需要铁的组织。DeDomenico 等发现如果胞外 Fe2+ 的浓度越高，膜铁转运蛋白与 Fe2+ 结合得就越多，而膜铁转运蛋白一旦与 Fe2+ 结合，就会被泛素化，之后就会被内吞溶解。而铜蓝蛋白负责将 Fe2+ 氧化成 Fe3+，降低胞外 Fe2+ 的浓度，切断膜铁转运蛋白与 Fe2+ 的结合，如果缺乏铜蓝蛋白，Fe2+ 的浓度就会上升，膜铁转运蛋白就会因为被内吞而减少，铁从细胞内释放就会减少，铁就会在组织细胞内积累。De Domenico 等还观察到铜蓝蛋白能够促进铁的转运，而不仅仅维持膜铁转运蛋白的稳定。Kono 等通过一个剂量敏感相关的反应，得出铜蓝蛋白对膜铁转运蛋白的表达还有一个有限的正调控作用。 三、遗传性低铜蓝蛋白血症仅仅是一种隐性遗传性疾病吗？ （原发性）遗传性低铜蓝蛋白血症从被认识以来一直被定义为常染色体隐性遗传性疾病。但是最近越来越多的文献报道杂合子发病的情况。McNeill 等分析了 33 个病例的基因型与表现型的关系，其中 28 例为纯合子发病，5 例为杂合子发病。最后结果得出基因型和表现型没有明显的相关性，但是纯合子倾向于有更严重的疾病，同时也暗示了杂合子也会发病。Parez-Aguilar 等报道了 1 例 39 岁无症状的杂合子男性，其血清铁蛋白明显升高，头部及肝脏 MRI 呈现铁沉积的成像，因此提出没有外显的杂合子病例最大可能是处于临床前期。Chen 和 Chen 通过对 2 例铜蓝蛋白基因突变杂合子的无症状患者经行 MRIT2 加权梯度回波检查，发现杂合子大脑也会出现铁沉积，然而这种大脑铁沉积量的水平需要到达一定的年龄才能检查得出，这也从一个侧面证明，杂合子临床症状的出现并不是与遗传因素（即基因型）相关，而是与足够时间的铁积累以及环境因素有关。当然我们也不能排除是由于复合杂合子的存在所导致的发病，上述的病例可能只是还没有发现另外的变异位点而暂时将这部分患者分类为杂合子。Loreal 等就报道过这样的病例，患者为复合杂合子，其 1 个等位基因上第 11 号外显子有 2 个碱基丢失，导致密码子（620-621）由 GGAGAT 变成 GAATTC，而在另一个等位基因上则发现 T694A 变异。那么，既然杂合子也有发病的可能，而且比较难以依据现有的化验以及影像学结果早期诊断，那么基因检查对早期鉴别出低铜蓝蛋白血症的杂合子显得更为重要。 四、结语 Floris 等在综述中提及，生理 pH 情况下，Fe2+ 能够自动氧化成 Fe3+，这一反应并不需要任何特别的催化剂，但会同时生成有害的氧自由基。铜蓝蛋白在控制 Fe2+ 氧化反应水平中起到非常大的作用，它能够竞争从而有效地减少 Fe2+ 的自动氧化反应。对于人体来说这是非常合理的，因为通过铜蓝蛋白亚铁氧化作用使 Fe2+ 转变成 Fe3+ 的反应，产生的是 H2O 和 O2，而不是 H2O2。同时，他们通过实验证实了铜蓝蛋白能够氧化 6- 羟基多巴胺（6- 羟基多巴胺是一种形成多巴胺 - 黑色素的中间产物），而且此反应的伴随产物是 H2O 和 O2。如果 6- 羟基多巴胺通过非铜蓝蛋白途径自动氧化，则会生成大量的 H2O2。换言之，铜蓝蛋白能够阻止 6- 羟基多巴胺自动氧化而产生自由基。近年来，大量的研究报道发现，帕金森病、阿尔茨海默病和 WD 等退行性疾病的发生与大脑产生大量自由基有关，而且通过神经影像学也发现，这些疾病在铜蓝蛋白易缺乏区的脑组织（纹状体、黑质、苍白球）有铁的沉积。所以继续深入研究铜蓝蛋白的作用机制，将有助于揭示神经退行性疾病的发病机制。而完善铜蓝蛋白基因研究，可通过基因检查早期鉴别出低铜蓝蛋白血症的纯合子患者，甚至是杂合子患者，及早进行干预治疗。
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