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【袁元的回答(33票)】: Too long no read的一句话回答（个人见解）：生物学试验的可重复性有多差？μg级分子学实验比较差，没办法量化这个差的程度，反正比有机合成要差。为什么这么差？实验影响因素多，耗时长，需要人工操作的地方多，人类本身就是最大的污染源和操作误差来源，无可避免。另外就是设计的实验本身从根子上就不稳定。 --------------------------------我是实验素质还不如大专学历专职实验室民工的分割线--------------------- 看见这个问题我心里默默留下了眼泪。我以前是学药学，毕设做的有机合成，后来转投合成生物学做研究生毕设，实验重复性问题起码让我一年的时间有半年在通过反复摸索条件做实验，都快用穷举法测试了。有时一次实验做出来很顺，下次再用同一个条件做，就不出结果了，然后开始挠墙，到底是样品有所变更导致条件不再适用，还是用的酶、试剂有问题等等。无奈之下只好反复测试，用消耗劳动力的方法往前冲。 以毕设为例，从初始质粒基因序列设计架构开始做到酵母荧光蛋白表达，基本是个from scratch的架势。其实说起来涉及到的实验就是PCR, plasmid extraction, electrophoresis, transformation in E.coil, transformation in yeast, E.coil and yeast cell culture, SDS-PAGE, RNA extraction, cDNA reverse transcription, RT-qPCR。重复性问题往往存在在需要数据的分子级实验上，养细菌这种粗暴的事情就无所谓了。 真正让我因为重复性烦躁到爆的实验，先排除掉electrophoresis和SDS-PAGE，电泳这东西简单粗暴，基本不存在重复性的问题。cell culture也排除掉，大肠和酵母比哺乳动物细胞耐操的多，基本都能乖乖生长（不考虑杂菌污染问题）。plasmid extraction对后续实验没什么影响，只要提出足够多的质粒供transformation就行，反正用来extraction的原料E.coil和yeast多的很，随便养过夜/2，3天就是一管子浓浓的菌/酵母。 剩下的就很痛苦了 1. PCR, RT-qPCR PCR的问题在于，正常20多30多个cycle，都是指数倍的增长，初始PCR管里的量又很少，不能和粗暴的有机合成比，一般一个PCR管里也就20～50μl的总量（模板DNA，dNTP，酶，水blabla），模板DNA可能有1-10μg，逼急了20μg的量我也放过。酶也就放1μl左右，用的枪头最小是0.5μl，那么问题就开始出现了，小枪头稍微不注意沾一点点没下去，或者点到PCR管壁上没充分混合（vortex不彻底，或者漏到PCR管的管帽与管之间），初始量就不太一致了，再加上后面指数倍的增长，误差就大了。上PCR机的时候，未必和以前用的是同一台（组里总共4台，都要分别预定时间），即使是设定的相同条件也会有微妙的影响。影响PCR的问题太多了，没能力一一详述，网上很多。 RT-qPCR和PCR差不多，但材料用的是珍贵的cDNA，一旦做仆街了，很不方便分辨是PCR过程的问题，还是原料cDNA制备有问题，为寻找问题优化实验带来困扰。同时制备cDNA是基于下面要说的RNA extraction，一个试剂盒好几千块，本科没做过，研究生才第一次做，我区区一个硕士生何德何能反复试错，这就是超越实验本身的现实考量了。 2. RNA extraction, cDNA reverse transcription RNA要在RNA室里提取，之前样品存放在-80℃冰箱里，在RNA室里戴手套口罩，用奇怪的液体喷桌子喷手套喷枪，尽量去除掉无处不在的RNA酶。虽然是用试剂盒，但提取的时候从细胞破碎开始做，做到RNA提取完用安捷伦的chip测浓度，基本就从中午做到晚上8点了，这么长时间的实验，影响因素无处不在，偏偏提取出来的量浓度又低，一般是几十μg/ml，误差反应出来可想而知。 3. transformation in yeast 我至今觉得想通过homologous recombination将一段基因transformation到yeast genome上属于理论很美好，现实很坑爹的事情，实验重复率极其可悲，可能我自己就是个实验技术极差的衰人，说起来都是眼泪。想转进去的基因上面自带antibody marker，最后皿里面好一点长几十个菌落很给面子，次一点长那么几个菌落也圆乎乎挺饱满的，衰一点就长一个，比长不出来还惨的是出一堆永远长不大的细微白点。货真价实的是通过反复试，才凑够最后的11种不同的engineer yeast。更更可悲的是我至今不知道是什么影响了实验重现性，为什么相同条件，基本大小一致的片段，有的就能成功转进去，长那么几十个，有的就长不出来。 质粒转到E.coil里倒是简单粗暴，基本没什么重复性问题。可能还是真核酵母太娇气，而且不是转质粒进去而是试图整合到基因组上去，成功率很低。 4. fluorescent protein expression 其实蛋白表达倒还好，一旦基因整合上去了，基本蛋白上还是能保持稳定表达的，毕竟基因组上的基因还是比质粒基因要稳定，另外你虽然不知道一个酵母里有几个质粒，但一个酵母里根据最初设计确实就整合了一段设计序列。做三份酵母平行样品表达荧光蛋白，最后测荧光强度计算RSD（标准差/平均值）低于10%我就谢天谢地了（没有强制要求，当然越低越好）。相比较而言，药典记载HPLC外标法重现性要求，对照品平行测5次样，峰面积RSD低于2%。 说了一堆废话，感觉没办法实质性的帮到题主，见谅 【知乎用户的回答(21票)】: 我认为生物学实验的可重复性并不差。当我们纯粹的谈论科学时，几乎一切现象都可以套用因果关系来解释。只要因果关系是成立的，那么实验就应该是可重复的。 但是，即使是CNS级别（Cell, Nature, Science三大期刊）的文章，也会有很多实验结果是重复不出来的。原则上，能够发表的数据，都应该是可以重复的。重复不出来只有两种可能，要么数据是不成立的，要么操作有问题。 如果一个实验结果，需要特定的人在特定的时间和地点来重复，那么这只能是一个站不住脚的，片面的实验。因果关系没有搞清楚，这个数据的权威性就要受到质疑。 至于操作的问题。很久以前，我也认为微升（μl）级别的分子生物学实验应该是极为精确的。师兄师姐和我说这些实验很粗放，我还不理解。慢慢地，我发现那些公认的结果，只要操作别太离谱，基本上怎么做怎么有，误差会存在，但不会有绝对的影响。 什么样是靠谱的操作呢？ 比如一把1000 μl的移液器，我要调到800 μl，应该从大往小调，即使现在在600 μl的位置，也应该调到800 μl以上再调回来； 比如配制生理盐水的时候用容量瓶； 比如用进口试剂，天平调至水平，离心之前先配平…… 这些都不用太在意！大部分公认的结果也是可以重复出来的。 但是有些操作太离谱了！比如辣根过氧化物酶偶联的抗体，是不能接触叠氮化钠的！说明书上白纸黑字写的清清楚楚，一遍又一遍做不出来怪谁？比如该换枪头的时候不换枪头，该喷酒精的时候不喷酒精，实验台堆得乱七八糟，自己懒的配试剂，不管过期与否拿来就用。 大多数情况下的操作失误是可以理解的。因为我们知道的总是有限的，在突飞猛进的开展课题时，难免力不从心。但是，能否避免这些失误，很大程度上决定着一个课题的成败。这就是执行力！ 上本科的时候还是idea重要的年代。现在谁还管你有什么idea啊？没有执行力等于零！ 我一个外单位的朋友，做的东西和美国科学院院士是一样的。他刚开始做的时候人家还不是院士，到现在做了四五年，人家文章成果无数。他每天要关心的问题是怎么养好小鼠，哪种试剂有效。有一次他们实验室要换装备，新的还没到货，旧的东西全扔了……需要做实验的同学去找，没了！这不扯淡吗？ 没有执行力，idea越好越可惜！ 
【刘阳的回答(11票)】: 要是给我一次能准确取 1nL 的pipette，能准确称 1 ng 的天平，一点都不沾的枪头，我想很多实验精度喝重复性都能保证，但事实上这些东西恐怕未来50年都做不出来，但偏偏生物实验都是这个量级的，10％内的误差就不错了。 另外一点就是，很多实验即便是重复多少误差也是在那里摆着。你能指望实验用的老鼠全都一模一样，心情一样happy，荷尔蒙水平一模一样，乖乖趴那里给你戳么？ 当然话说回来，生物实验平行实验，以及对照试验的设计都很重要，合适的统计方法也会左右最终的结论。 【孙利得蒙克的回答(2票)】: 生物学实验的可重复性有多差？ 很差。 不是同一个人操作，结果不可能一样。 就算是同一个人操作，每次也都有那么点不一样。 最简单的、单纯的有机化学反应，不同的人、相同方法做出来的相同物质，纯度也有高低之分。 而这个高低之分，和操作者的动作熟练程度、对化学反应的理解程度、对细节的控制程度、实验过程中人品爆发程度息息相关。。 生物学实验涉及到的不是单一的化学反应，而是多个反应同时进行。（注意，这里的多的数量级至少应该和房价差不多。。。） 人类就算有能力单独解释清楚所有的化学反应，但多种反应同时进行。。。（这个要是能弄清楚了我们的中药就宇宙霹雳无敌主宰了。） 就从我正在做的生物大分子实验说：（小硕毕业也好难阿 T^T） 蛋白质是个很有个性的东西，酸碱度（pH）不同、温度不同、浓度不同、溶剂不同，它都能盘曲折叠出不同的空间结构。有时盘曲折叠的不好呢，它会露出肚皮，有时候又把头盖住。当它把脸露出来的时候……啊！！是隔壁的王蜀黍啊！！！！来来来，胃里有一坨东西你帮我把它消化掉。 微小的差别，蛋白质就会有不同的型态和功能。而受到影响的指标（人工、环境）又太多，以目前技术和设备的水平，难以达到实验条件完全不发生变化的理想状态。 所以，重复性差。情理之外，意料之中。 【wendyy2007的回答(1票)】: 除了技术上的问题，更重要的是生物体本身影响因素太多，调控上也是呈现网状结构，所以实验环境的一些变化对材料的影响很大。不记得那个杂志（反正IF比较高的一个）上面发的文章，说是80%以上不可重复。这并不是这些文章在造假，而是在那个实验室，他们当时做实验的条件下做出来的结果就是这样。变量太多了，很多都难以控制。所以现在都强调实验条件的标准化。但是实际情况，大家都知道的…… 举个自己的例子，本人是做果蝇的，表面上实验室温度，湿度都调控在恒定状态，但到了三伏天的时候，果蝇就是长不好，产了卵不孵化，实验做出来的结果和以前比，重复性极差，简直是风中凌乱。 至于技术上的问题，赞同袁元的。重复性差，只能尽量做的严格一点，另外就是重复，多做重复，然后综合数据，基本上还是可以体现真实结果的，bar也会小点。 【王欣的回答(2票)】: 无可救药的差。 实验室的条件不完善。仪器设备老化严重。人为误差。样本误差。 组织特异性稳定性差。 试剂盒误差。实验室环境稳定性差。 话又说回来，绝对合适的环境和具备完好仪器设备的实验室不会常有。还是要尽量在同一状态下进行重复实验，摸索最佳适宜条件。 心静。稳！准！狠！ 【知乎用户的回答(0票)】: 变化量太多，精度太差，人为因素太多（其实生物还是非常需要技巧的有木有）； 然后我觉得最重要的就是： 我们对于生物本身知道的太少了！！！！！！！！！ ！！！！ 所以我当年大一暑假做了四个月纯生物实验就转生信了！！！！！（从此上了另一条贼船呵呵呵） 原文地址:知乎 |
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