原理易懂，数据难分析

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，简称qPCR）技术，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

qPCR常用的分析方法包括相对定量和绝对定量，目前市场上用的常用的是相对定量--即 SYBR荧光染料法，该方法实验前需要RNA提取、反转cDNA、设计qPCR引物等操作；实验设计一般需要考虑设置内参基因、以及阴性/阳性对照等；实验结束后需要对Ct值、扩增曲线、以及融解曲线数据进行分析。

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qPCR实验前准备

（一）RNA模板

实验开始前，必须要保证RNA的纯度、浓度、以及完整性质检达标后才能进行后续的实验。RNA模板要求如下：

保证RNA一级结构的完整性。

纯度高：不存在其他核酸分子（DNA、游离核苷酸等）污染；不存在对酶存在抑制作用的有机溶剂、金属离子污染；以及蛋白质、多糖和脂类等污染。

浓度高：一般浓度可以用于反转录实验要求。

（二）qPCR引物设计原则

引物长度建议为18~30 bp；GC含量为40～60%；引物要跨内含子，避免引物内含有互补序列等。通常引物终浓度0.2μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1~1.0 μM范围内调整引物浓度。

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实验设计--内参基因

内参基因，也称为管家基因，其表达水平不受任何内源性与外源性因素的影响。内参基因高度保守，在不同类型的细胞和组织中稳定表达，且其表达量无显著性差别。进行qPCR相对定量检测时，必须使用内参基因，目前常用的内参基因包括：GAPDH、β-actin、以及18s rRNA等。

内参基因的作用

▶ 消除终产物定量所造成的不准确性

▶ 纠正样本加样的差异

▶校准PCR抑制物影响

▶ 校准cDNA合成效率差异

内参基因的要求：

▶ 不干扰目的基因组DNA的扩增；

▶ 具有高度或中度表达水平 ,排除太高或低表达；

▶ 在不同类型的细胞和组织中稳定表达，且其表达量无显著性差别；

▶ 表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；

▶ 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。

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实验设计-阴性/阳性对照

qPCR实验设计过程中，为了避免模板污染、仪器操作失误等因素导致的实验不合格现象，还需要做阴性和阳性对照实验。

阳性(+)对照

可以用带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸、质粒DNA、克隆重组质粒、体外反转录的RNA、来自于特定的生物体样本的RNA或DNA及国际上公认的生物学标准品等。阳性对照可以帮助我们快速判断，是试剂失效还是仪器故障导致实验失败。

阴性(-)对照

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数据分析-- -△△Ct

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始浓度的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小。可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，用于基因表达量差异或基因拷贝数的结果计算。一般通过计算2-△△Ct，对目的基因进行进行相对定量分析。

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数据分析-- 扩增曲线&融解曲线

1.扩增曲线

扩增曲线是平滑S型曲线，要保证所有样本的起始无扩增、阴性对照（NTC和NRC）无荧光信号--即没有S型扩增曲线、且保证扩增起峰时间正常。

图1：扩增曲线示意图（图片来源于网络）

2.融解曲线

融解曲线一般呈现单峰，峰值对应的是目的产物的Tm值，Tm值和目的产物的种类有关，不会因为模板量的高低、引物浓度的变化等外界因素发生改变。理想中的单峰的宽度一般较小，阴性对照（NTC和NRC）均无较高的峰出现。

图2：融解曲线示意图（图片来源于网络）

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部分实验数据

1.兼容性完美，全平台通用：提供ROX Reference Dye I和II预混液，适用于所有主流定量PCR仪器。

2.灵敏度高：采用独特优化的反应Buffer，可检测低至10 pg的cDNA模板。

图3：将质粒进行8个10倍梯度稀释，以5×107~1010拷贝/µl的质粒为模板，进行扩增。发现扩增效率高，且可获得良好的线性关系。

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文：Alice

排版：市场部