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1. TaqMan探针检测MiRNA的原理是什么？ 答：在PCR的过程中，TaqMan MGB探针会特异性地结合到与其互补的序列上，这个序列在下游引物与下游引物之间，如下所示： 图例如下： 在复制时，，上游引物延伸出来的片段就会与TaqMan MGB探针接触，如下所示： 其中，上游引物上的DNA聚合酶（橙色圆圈，带Ｐ的那个）会切除掉与序列互补的探针，如下所示： 被切掉的报告染料（标记为R的青色圆圈，染料为FAM）就会从探针上游离出来，发光。报告基因在探针上不发光是因为探针上有一个淬灭基因，即NFQ，它能与Ｒ中和，使Ｒ不发光，但当R游离出来后，R就能发生了。此外，MGB的作用是，一是在不增加探针长度的条件下，提高解链温度（Tm），二是缩短探针的长度。而探针的3’端是被阻断的，因此探针的3’末端并不会发生延伸。 注：在做实验时，特定的miRNA Taqman需要订制，订制与合成时间约为1个月。 2. 最近要做miRNA的定量检测，使用的方法为TaqMan探针，手中的所有试剂如下所示： ①TaqMan(TM) MicroRNA Reverse Transcription Kit（货号：4366596）；②Taqman Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit（货号：A28007）；③TaqMan™ Fast Advanced Master Mix（货号：4444556）；④TaqMan Advanced miRNA Assays（针对miRNA-21-5p）。 3. 在利用Taqman探针检测miRNA时，需要哪些试剂盒？ 答：需要三个试剂盒，第一个是Taqman Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit（货号：A28007），这个试剂盒用于反转录RNA，生成的cDNA用于下一步的qPCR。第二个试剂盒是TaqMan™ Fast Advanced Master Mix（货号：4444556），第三个试剂盒是TaqMan Advanced miRNA Assays，第二个试剂盒就是qPCR的预混液，它需要与第三个试剂盒配合使用，第三个试剂盒里面只有一管试剂，其主要成分是包含某个miRNA的特异性上、下游引物和FAM标记的MGB探针的混合物，用于miRNA的定量qPCR检测。 4. 在做qPCR时，通常需要几个重复？ 答：通常需要3个生物学重复，每个生物学重复又需要3个技术重复。生物学重复是指我要取3只小鼠的样本，技术重复是指，对一个样本来说，检测3个孔，这是避免操作上导致的误差而设计的重复实验，其实就是复孔。 除了研究的样本外，还要有阴性对照孔，其中阴性对照孔又分为NTC与NRC，NTC（No-Template Control），没有模板的对照，用来验证实验材料是否具有污染。一般以水作为模板，如果有荧光反应，说明实验室有核酸污染发生。这些污染来自于：水不纯，不合格的试剂含有内源DNA，引物污染，实验室器材污染，气溶胶污染等等，需要使用RNase清除剂和RNase抑制剂。气溶胶污染是最不容易发现的，想象一下你的实验室就像雾霾，空气中悬浮着各种核酸。 NRT (No-Reverse Transcriptase)，没有反转录的对照，是未经反转录的RNA作为阴性对照，这是对gDNA（即基因组DNA）残留的控制。在做基因表达时，通过检测反转录后的cDNA量来检测RNA的量，那么如果在提纯RNA时有gDNA的残留，就会造成实验结果的误差，因为实际得到的结果是gDNA和cDNA的总体水平而不仅仅是cDNA的，需要在提取RNA的时候彻底去除gDNA。 因此，在进行某个基因检测时，如果实验的干预条件只有一个，则需要个孔，分别为：实验组3个生物学重复，每个生物学样本3个技术重复，再加上内参基因，再乘以2（对照组），一共是36个孔（这里没有计算NRT与NTC），如下所示： 5. 如何计算qPCR的结果？ 答：对于qPCR的结果，通常是采用ΔΔCt的方法（相对表达法，非绝对表达法），方法如下所示： 用内参基因的Ct值均一化目标基因的Ct值，例如 第一步：均一化： ΔCt（实验组的目的基因）=Ct（实验组的目的基因）-Ct（实验组的内参基因） ΔCt（对照组的目的基因）=Ct（对照组的目的基因）-Ct（对照组的内参基因） 第二步：与对照组相比 ΔΔCt（实验组的目的基因）=ΔCt（实验组的目的基因）-ΔCt（对照组的目的基因） 第三步：计算表达水平： FC（fold change，实验组目的基因的表达倍数）=2-ΔΔCt |
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来自： starsea1128 > 《miRNA》
